‘黄花’梨及其芽变‘绿黄花’梨HHT基因克隆与表达分析

该试验以砂梨品种‘黄花’梨（果皮褐色）及其芽变‘绿黄花’梨（果皮绿色）盛花后第8周的果皮为试材,利用常规PCR和巢式PCR技术克隆了ω-羟基棕榈酸O-阿魏酰转移酶（ω-hydroxypalmitate O-feruloyl transferase,HHT）基因cDNA的全长,命名为PpyHHT（登录号为KX131155）。序列分析结果表明,该基因开放阅读框（ORF）为1 335bp,编码444个氨基酸。生物信息学分析显示,推定的PpyHHT蛋白质相对分子质量为49.91kD,等电点是4.75,与白梨相似性高达98%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）表达分析显示,2种梨果皮中PpyHHT基因在盛花后6～9周的4个转色关键期表达量不断变化,在‘黄花’梨果皮中的表达量明显高于‘绿黄花’梨。推测PpyHHT基因可能参与砂梨果实褐色/绿色性状的形成。

hHT/GFP融合基因表达载体的构建及在小鼠成纤维细胞中的表达

为探讨超急排斥反应(hyperacute rejection,HAR)及延迟性异种排斥反应(delayed xenograft rejec-tion,DXR)分子调控机制,进行-α1,2岩藻糖苷转移酶基因(hHT)与绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)融合表达载体pEGFP-C1-hHT的构建及在小鼠成纤维细胞表达的研究。采用脂质体法转染小鼠成纤维细胞48 h后观察到GFP阳性细胞。同时对GFP阳性小鼠成纤维细胞进行PCR及Western blot,检测hHT基因的整合及表达情况。PCR结果表明hHT基因整合入小鼠基因组,Western blot检测到hHT基因的表达。研究结果表明,成功克隆hHT基因并构建了融合表达载体pEGFP-C1-hHT,可应用于进一步转基因研究。