hIFN-β基因重组腺病毒载体的构建

目的构建hIFN-β基因的腺病毒载体,为探索hIFN-β在肿瘤基因治疗中的作用作准备。方法从健康人外周血中提取出基因组DNA,pyrobestTaq酶PCR法扩增出hIFN-β基因片段。将目的基因克隆入中间载体pMD18T载体,经蓝白筛选和PCR筛选后测序证实序列无误。酶切目的基因并将之克隆入穿梭载体pAdTrackCMV中,将新形成的pAdTrackCMVhIFNβ用限制性内切酶PmeI线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy1共转染大肠杆菌株BJ5183细胞中。卡那霉素及酶切筛选出重组子pAdhIFNβ,内切酶pacI再次将重组子线性化,脂质体转染细胞株HEK293。借助GFP的表达可以在转染的2～3天观察到包装病毒AdhIFNβ产生,7～10天出现病毒斑。结果经PCR法及酶切证实各中间过程载体,且最终的包装病毒中携带有目的基因hIFNβ。结论大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便的构建出含有目的基因的腺病毒载体AdhIFNβ,重组子能够在HEK293细胞中扩增。

rhIFN-β1a cDNA在CHO细胞上的表达

目的 在CHO细胞上表达rhIFN βcDNA。 方法 利用脂质体技术 ,将含hIFN β基因的pRC CMV IFNβ DNA载体和pSV2dhfr DNA质粒按 3∶1的比例转染CHO k1dhfr 细胞 ,后者是选择性标记。筛选在缺乏胸腺嘧啶的选择培养基生长的单个细胞克隆 ,通过MTX加压扩增与dhfr基因共转染IFNβ基因。筛选的细胞株通过大规模培养 ,收集培养液经一系列的步骤纯化。结果 能够耐受 0 .6 μmol LMTX的细胞可产生IFN 10 5unitperday 10 6cells ,CHO细胞中表达的hIFN β纯化后的抗病毒比活性可达 2 .2× 10 8IU mg。结论 建立了适合表达人干扰素

重组hIFN-β腺病毒对食管癌细胞增殖及细胞周期的影响

背景与目的:Ⅰ型干扰素包括IFN-α和IFN-β,是多功能的细胞因子,具有抗病毒,抗增殖,抗血管生成及免疫调节作用。许多研究已经证明,IFN-β能明显抑制多种肿瘤的生长。然而,IFN-β蛋白极短的半衰期是临床应用中面临的主要问题。此外,临床实验表明最大剂量给药后机体IFN-β血清浓度远远低于抗肿瘤效应所需要的有效药物浓度。由载体介导的基因治疗解决了这一难题。许多研究已经表明,腺病毒载体介导的IFN-β基因能在肿瘤组织局部高效表达,抑制这些肿瘤细胞和组织的生长,并能诱导其凋亡。所以,基因治疗是一种具有应用前景的治疗手段,本实验用重组腺病毒载体转染食管癌细胞,观察腺病毒(Ad)介导的hIFN-β基因对人食管癌细胞体外增殖及细胞周期的影响。方法:重组腺病毒AdhIFN-β转染食管癌细胞系KYSE150,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从RNA水平检测hIFN-β基因在KYSE150细胞中的表达,细胞生长抑制实验、集落形成能力实验检测hIFN-β基因对KYSE150细胞的体外增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测细胞周期改变。结果:重组腺病毒经HEK293细胞扩增、纯化后滴度可达2×1011pfu/ml,且30 MOI(multiplicity of infection)的病毒可使95%以上的KYSE150细胞感染;RT-PCR检测到外源性hIFN-β基因在KYSE150细胞中的表达;MTT实验和集落形成能力实验表明,与对照组相比,AdhIFN-β转染后细胞生长受到明显抑制;流式细胞仪检测显示细胞阻滞于S期。结论:腺病毒介导的hIFN-β基因能抑制食管癌细胞的增殖及诱导S期阻滞,为该基因应用于食管癌的治疗提供了理论基础。