重组人γ-干扰素表达菌株的构建

从健康人外周血分离单核细胞,并提取总RNA,利用RT-PCR扩增出hIFN-γ基因。构建了重组表达菌株BL21(DE3)(pET32a(+)-hIFN-γ)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pET32a(+)-hIFN-γ含有hIFN-γ基因,且基因序列和阅读框架正确。经W estern blot鉴定证实为hIFN-γ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达。表达产物占菌体总蛋白的52%。同时对其抗病毒活性进行了测定,从而为hIFN-γ的生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据。

人γ干扰素的高效表达

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含hIFN-γ基因的重组质粒,SDS-PAGE检测不同条件下hIFN-γ基因的表达情况,用Western blot和亲和层析对表达产物进行鉴定和纯化,并对表达条件进行优化。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实重组质粒pET32a(+)-hIFN-γ含有hIFN-γ基因且阅读框架正确,以IPTG诱导hIFN-γ基因表达的优化条件是:培养基pH7.0,培养温度37℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时hIFN-γ蛋白表达量为52%。从而实现了hIFN-γ基因的高效表达并优化了其表达工艺。从而为hIFN-γ的生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据。