hIL-13融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

通过ＲＴＰＣＲ技术直接从激活的健康人外周血单个核细胞（ＨＰＢＭＣ）中扩增出约０３ｋｂ的ｈＩＬ１３基因片段，经ＤＮＡ重组技术，插入到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ２中，转化入感受态的大肠杆菌ＴＧ１中，成功地构建了ｈＩＬ１３的基因工程表达菌株ｈＩＬ１３ｐＧＥＸ４Ｔ２／ＴＧ１。经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后表达的ＧＳＴＩＬ１３融合蛋白经ＳＤＳＰＡＧＥ证明分子量约３６ｋＤ，表达量约占菌体蛋白总量的１０％～３０％。复性后ＩＬ１３融合蛋白的生物学活性可达８０～１２０Ｕ／ｍｌ。复性后的融合蛋白经凝血酶作用后，可被切割成２６ｋＤ的ＧＳＴ与１０ｋＤ的ｈＩＬ１３。

人白细胞介素11cDNA的克隆、融合表达及活性测定

取人胎肺做原代培养细胞 ,PMA诱导后 ,利用RT PCR技术 ,扩增出了去掉N端信号肽序列的IL 11cDNA ;经序列分析表明 ,该序列与文献报道序列高度同源 ,仅 3个核苷酸有变化 ,氨基酸序列完全一致。将此IL 11cDNA克隆入硫氧还蛋白基因融合表达载体 pTRXFUS的trxA基因 3′末端 ,利用其 3′端的蛋白肠激酶切点 ,构建符合读码框的融合基因。该融合蛋白在大肠杆菌中表达量达 2 0 %以上。用IL 6依赖细胞株 7TD1及MTT法测定生物学活性 ,达 2 5 6× 10 5u/mL菌液 ,对融合蛋白进行了Westernblot测定 ,并对表达条件作了初步研究。

融合蛋白表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建人类regucalc in重组原核表达载体。方法用RT-PCR的方法从人类肝癌细胞系HepG2中扩增出regucalc in基因cDNA序列,应用T克隆载体及pET-32 a(+)表达载体后,将质粒转化进入原核表达菌株进行表达。结果表达产物经SDS-PAGE电泳分析后,在45 000处有一明显表达条带,与理论结果相符。结论成功构建融合表达载体Pet-regucalc in,并在原核细胞中表达出人类regucalc in-H is融合蛋白。