hIL-13融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

通过ＲＴＰＣＲ技术直接从激活的健康人外周血单个核细胞（ＨＰＢＭＣ）中扩增出约０３ｋｂ的ｈＩＬ１３基因片段，经ＤＮＡ重组技术，插入到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ２中，转化入感受态的大肠杆菌ＴＧ１中，成功地构建了ｈＩＬ１３的基因工程表达菌株ｈＩＬ１３ｐＧＥＸ４Ｔ２／ＴＧ１。经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后表达的ＧＳＴＩＬ１３融合蛋白经ＳＤＳＰＡＧＥ证明分子量约３６ｋＤ，表达量约占菌体蛋白总量的１０％～３０％。复性后ＩＬ１３融合蛋白的生物学活性可达８０～１２０Ｕ／ｍｌ。复性后的融合蛋白经凝血酶作用后，可被切割成２６ｋＤ的ＧＳＴ与１０ｋＤ的ｈＩＬ１３。

野生型和突变型人白介素13哺乳细胞表达质粒的构建

目的:构建野生型及突变型人IL-13(hIL-13)哺乳细胞表达质粒。方法:采用融合PCR扩增人生长激素(hGH)-hIL13融合蛋白编码序列。PCR产物和pcDNA3.1表达载体经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切处理后,将PCR产物定向插入pcDNA3.1真核表达载体中,构建质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g。将其转化到DH5α感受态细胞内进行扩增,阳性克隆鉴定,质粒抽提,进行测序验证。结果:重组质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g经测序验证,hGH-hIL13融合蛋白编码序列与实验设计一致,且已与pcDNA3.1(+)真核表达载体正确重组。结论:成功构建了哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g,为后续野生型及突变型hIL-13哺乳细胞的重组表达奠定了基础。

IL-13融合蛋白表达载体与非融合蛋白表达载体的构建与比较

采用RT－PCR技术直接从激活的健康人外周血单个核细胞中扩增得到hIL－13的基因片段，通过DNA重组技术分别将其插入到含有PRPL启动子的高效表达载体pBV220及含tac启动子、lac1阻遏蛋白基因及凝血酶识别位点的融合蛋白表达载体pGEX－4T－2中，成功地构建了hIL－13的原核非融含蛋白表达菌株hIL－13－PBV220／DHS5a及融合蛋白表达菌株hIL－13－PGEX－4T－2／TG1，分别经42℃热诱导及异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）化学诱导后，SDS－PAGE结果表明IL－13仅以GST融合蛋白的形式在E.coli中获得了表达，表达量约占菌体蛋白总量的10％～30％。IL-13的蛋白单体在原核细胞中表达量很低。

IL-13 cDNA探针的制备及应用

采用缺口平移的方法用生物素标记hIL-13的cDNA片段作为探针,检测传代培养的肿瘤细胞株中IL-13的基因表达,RNA斑点杂交和Northern杂交的结果均显示这些肿瘤细胞株有不同程度IL-13基因的表达.该探针本身的显色灵敏度较高,用5～10pg量的探针点膜可见明显的显色.探针的特异性良好,含IL-13mRNA的核酸杂交结果呈阳性,而不表达IL-13基因的RNA与该探针的杂交结果呈阴性.IL-13cDNA探针的制备为进一步研究IL-13的生物学特性提供有效的手段.