rhIL-15表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 获得rhIL 15基因工程菌。方法 从肺癌细胞株A549中提取细胞总RNA ,用RT PCR法扩增编码人IL 15成熟区基因的片段。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后 ,插入融合表达质粒pGEX 4T 2的相应酶切位点 ,构建重组融合蛋白表达质粒 ,并转化感受态大肠杆菌BL2 1而得到工程菌。结果 重组质粒插入片段核酸序列测定的结果 ,与文献报道的IL 15蛋白成熟区的核酸序列相一致。该工程菌所表达的融合蛋白多数以包涵体的形式存在 ,占菌体蛋白总量的 39%。复性后 ,纯化的rhIL 15蛋白经MTT比色法初步测定 ,具有促进CTLL 2细胞增殖的能力。结论 获得了具有生物学活性的rhIL

人白细胞介素15(hIL-15)的基因克隆和序列测定

ＩＬ１５是一种促进Ｔ细胞、Ｂ细胞和ＮＫ细胞生长和分化的细胞因子。本文用ＲＴＰＣＲ方法，自行设计并合成两对引物，成功地从成人脾脏中扩增出ｈＩＬ１５ｃＤＮＡ，并定向克隆入ｐＵＣ１９载体中。经序列测定证实，为ｈＩＬ１５成熟肽ｃＤＮＡ基因。ｈＩＬ１５基因的获得，为进一步在大肠杆菌中高效表达有活性的重组ＩＬ１５，更深入地研究其作用机理，以及临床应用奠定了基础。

hIL-15成熟肽段基因的克隆及其原核表达载体的构建

本文采用ＲＴＰＣＲ的方法自成人脾脏中扩增出ｈＩＬ１５成熟肽段基因，定向克隆入ｐＵＣ１９中，筛选带有插段的阳性克隆。经序列测定证实后，插入大肠杆菌融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１中，构建重组表达质粒ｐＧＩＬ１５。ＳＤＳＰＡＧＥ证实ｐＧＩＬ１５大肠杆菌中可表达分子量为３８６ｋＤ的融合蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的１８５％。目的蛋白经纯化后具有促进靶细胞ＤＮＡ合成的作用。

人IL-15cDNA真核表达载体的构建及其在BEL-7402细胞中的表达

目的 :构建人白细胞介素 - 15 (hIL - 15 )真核表达载体并在肝癌细胞BEL - 74 0 2中表达 ,为进一步研究IL - 15的功能及临床应用奠定基础。方法 :采用RT -PCR方法自正常成人外周血单核细胞中扩增出hIL -15cDNA ,将其克隆至T -vector中 ,经测序确证后 ,将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1hisB中 ,脂质体法转染BEL - 74 0 2细胞进行表达 ,鉴定表达产物的生物学活性。结果 :测序结果与已报道hIL - 15cDNA序列一致。脂质体转染后获得 6个BEL - 74 0 2细胞阳性克隆 ,IL - 15活性测定为 15 6～ 2 5 2u/ml。结论 :成功地构建了真核表达载体 pcDNA3.1hisB -IL - 15 ,IL - 15cDNA转导的人BEL - 74 0 2肝癌细胞可表达有生物活性的IL - 15。

人IL—15cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建人白细胞介素－１５（ＩＬ－１５）ｃＤＮＡ真核表达载体，以期在哺乳类细胞中获得高效、稳定表达。方法 从外周血粘附性单核细胞（ＰＢＭＣ）中提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ方法获取了人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ，并与ｐｃＤＮＡ３．１质粒的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ位点定向连接，构建受控于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的重组真核表达载体ｐｃＤＮＡ３１－ＩＬ－１５。结果 经ＰＣＲ扩增鉴定和ＤＮＡ序列分析，证明ＩＬ－１５已经正确插入克隆载体且序列正确。

人白细胞介素15 cDNA克隆及其在大肠杆菌中表达

从ＬＰＳ活化的人外周血单核细胞总ＲＮＡ中，用ＲＴＰＣＲ方法扩增出编码成熟人白细胞介素１５（ｈＩＬ１５）的ｃＤＮＡ，并将其克隆于ｐＢｌｕｅＳｋｍ质粒中，序列测定结果与预期一致。再将ｈＩＬ１５ｃＤＮＡ克隆于表达载体ｐＢＶ２２０，构建了高效表达克隆ｐＢＶＩＬ１５。热诱导４ｈ，ｈＩＬ１５蛋白表达即达高峰。表达的重组蛋白经ＳＤＳＰＡＧＥ及凝胶密度扫描分析，分子量约１３ｋＤ，占菌体总蛋白的３３％，经包涵体提取及ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１００凝胶过滤纯化，重组蛋白纯度达９５％以上。