中国流行株HIV-1gag和hIL-2/hIL-6核酸疫苗构建与实验免疫研究

目的探讨中国流行株 HIV- 1gag与 h IL - 2 /h IL - 6共表达重组核酸疫苗质粒的免疫效果。方法以核酸疫苗质粒 p IRES1neo为表达载体 ,构建重组核酸疫苗质粒 p IRES1- gag、p IRES1- gag- h IL- 2、p IRES1- gag- h IL- 6 ,通过间接免疫荧光试验、Dot- EL ISA检测 gag/h IL - 2 /h IL - 6基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫 Balb/c小鼠 ,进行淋巴细胞转化试验、CD4+ 、CD8+ T淋巴细胞数量测定、细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL )特异性杀伤作用检测及血清抗体检测 ,结果构建的重组质粒转染 BHK细胞后可表达目的基因 ,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖、诱导特异性 CTL 反应 ,当和 h IL- 2 /h IL- 6共表达时免疫效果更加显著。讨论与 Gag蛋白共表达的 h IL- 2 /h IL- 6能够进一步增强免疫鼠的细胞免疫与体液免疫水平 ,构建的重组质粒为 HIV-

HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因联合诱导人宫颈癌Ca Ski细胞的凋亡

目的:观察HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因体外共转染,联合诱导人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的效应。方法:HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因的质粒载体分别以单独或联合的方式转染人宫颈癌Ca Ski细胞,随后利用RT-PCR技术检测细胞中HPV-16 E6癌基因的mRNA水平变化;Western blot分析细胞中抑癌蛋白p53水平的变化;流式细胞技术分析细胞凋亡情况。结果:经HPV-16 E6 siRNA和hIL-24转染后细胞后HPV E6癌基因的mRNA水平均下降,其中联合转染组显著下降(P<0.05);抑癌蛋白p53水平均增高,其中联合转染组显著增高,细胞凋亡率均升高,其中联合转染组显著升高(P<0.05)。结论:HPV-16 E6 siRNA与hIL-24基因分别转染宫颈癌Ca Ski细胞后,均能抑制Ca Ski细胞中HPV-16 E6癌基因的表达,使抑癌蛋白p53恢复活性,诱导宫颈癌Ca Ski细胞凋亡;两者联合则具有协同效应,能显著提高肿瘤细胞凋亡率。

在重组痘苗病毒中共表达HIV-1p24gag与hIL-6基因

以ＨＩＶ－１ ｐ２４ｇａｇ 与ｈＩＬ－６ 基因在重组痘苗病毒中的共表达研究为目的，将痘苗病毒复制非必需区血凝素（ＨＡ） 基因作为侧翼，把编码人白细胞介素６（ｈＩＬ－６）的基因片段克隆到真核表达质粒ｐ１６ＱＦ１ －２４ 的下游，构建成含有ＨＩＶ－ １ｐ２４ｇａｇ 和ｈＩＬ－６ 两种外源基因的重组表达质粒ｐ１６ＱＦ２４ －ＩＬ６ ，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选，获得了重组痘苗病毒ｖ１６ＱＦ２４ －ＩＬ６．经间接免疫荧光试验、Ｄｏｔ－ ＥＬＩＳＡ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ 等检测证明，重组病毒能同时表达ｐ２４ｇａｇ 蛋白和ＩＬ－６ 蛋白，表达产物的相对分子质量分别为２－４×１０４ ，２－６×１０４ ．此种方式表达的外源蛋白持续释放，可产生更强的免疫效果，可望用于ＨＩＶ疫苗的研究．

结核分枝杆菌HSP65-hIL-2融合基因稳定转染细胞系的建立

建立可稳定表达结核分枝杆菌HSP65-hIL-2融合蛋白的稳定转染P815细胞系。在阳离子脂质体作用下,将HSP65-hIL-2真核表达质粒转染与BALB/c遗传背景一致的P815细胞(H-2d)。G418筛选阳性克隆,RT-PCR和间接免疫荧光法检测目的蛋白的转录和表达。阳性克隆细胞经RT-PCR检测到HSP65-hIL-2融合基因特异性的mRNA表达;用鼠抗人的IL-2mAb进行间接免疫荧光检测,可在转染的P815细胞浆中观察到较强的绿色特异性荧光,而未转染细胞则为阴性。成功获得稳定表达HSP65-hIL-2融合蛋白的稳定转染细胞系,为其疫苗的CTL研究提供了合适的靶细胞。

rhIL-6大肠杆菌高效表达的影响因素及其产品中试的研究

研究自构建的重组人白细胞介素－ ６（ｒｈＩＬ－６）基因工程菌株高效表达的影响因素及其ｒｈＩＬ－６产品中试工艺。方法：①将ｒｈＬ－６－ＰＢＶ重组质粒转化至ＲＲＩ、ＪＭ１０３和 ＤＨ５ ａ不同宿主菌中，在Ｍ９ＣＡ和 ＬＢ培养基中，４２℃诱导培养不同时间（３～６ ｈ），观测 ｒｈＩＬ－６不同表达效率。②采用 １０ Ｌ发酵罐诱导培养，经破菌－洗包－溶包初步纯化后，再经三步柱层析纯化，提取ｒｈＩＬ－６。结果：①ｒｈＩＬ－６在ＤＨ５ ａ大肠杆菌中（ＳＤＨ－９４５株）表达效率高；可达 ３９％，用 Ｍ９ＣＡ培基，４２℃诱导培养 ５ｈ可使表达效率提高到４１％，②ＳＤＨ－９４５菌株在５批 １０Ｌ Ｍ９ＣＡ发酵诱导培养 ５ ｈ，ｒｈＩＬ－６表达效率可达 ３５． ８７±２． ６５％。经初步纯化后，ｒｈＩＬ－６的纯度达 ７４． ８７±３． ６８％，再经三步柱层析后，纯度可达 ９５％以上，比活性达 ４ × １０８ Ｕ／ｍｇ，总得率稍低可达 ２３．１％．结论：①ＳＤＨ－９４５工程菌株在 Ｍ９ＣＡ培养基巾，４２℃诱导培养 ５ ｈ，ｒｈＩＬ－６表达效率最佳。②１０ Ｌ发酵和纯化工艺可获高效价、高比活性、高纯度的ｒｈＩＬ－６合格生物制品。

hIL-12及HER2/neu ECD修饰的生孢梭菌工程菌的构建及鉴定

目的构建人IL-12(hIL-12)基因和乳腺癌靶基因HER2/neu胞外区(ECD)分别修饰的生孢梭菌工程菌,探讨其在乳腺癌基因治疗中的作用。方法将hIL-12和HER2/neu ECD的基因分别连接到厌氧梭菌的内源性β-1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽序列(eglAp)之后,得到融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu。将融合基因插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,得到重组质粒pIMP1-ehIL-12和pIMP1-eHER2/neu。将重组质粒首先转化大肠杆菌DH5α,通过酶切和测序鉴定无误后,再用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,采用菌液PCR和质粒提取鉴定阳性克隆,采用ELISA法对生孢梭菌培养上清中目的产物进行分析。结果酶切和测序结果表明重组质粒内的融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu序列和读框正确,菌液PCR、质粒提取和ELISA结果显示hIL-12和HER2/neu ECD基因成功修饰生孢梭菌并表达。经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带和表达外源基因。结论成功获得hIL-12和HER2/neu ECD基因分别修饰的生孢梭菌工程菌株,为进一步的抗肿瘤研究奠定基础。

HIV-1中国流行株gag与hIL-2在重组痘苗病毒中的共表达及其与核酸疫苗的实验免疫研究

目的：将HIV-1中国流行株B亚型gag基因、gag和hIL-2基因在天坛株痘苗病毒中进行共表达，以期获得重组痘苗病毒，观察细胞因子的佐剂作用，与核酸疫苗混合免疫，评价免疫效果，为新型艾滋病疫苗研制开发打下基础。方法：将HIV-1中国流行株 gag基因、gag和hIL-2基因片段插入到 pJ38载体启动子下游，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒，SDS-PAGE、Western blot检测目的蛋白。以重组病毒和核酸疫苗免疫Balb/c小鼠，进行淋巴细胞转化实验、CTL、CD4+、CD8+ T细胞数目以及血清抗体的细胞免疫和体液免疫指标检测。结果：获得了重组痘苗病毒 vJ38gag和 vJ38gag-IL-2。与 vJ38-gag相比，vJ38gag-IL-2，具有更好的免疫原性，重组痘苗病毒免疫3次的效果好于重组病毒免疫2次，以2rVV-DNA混合免疫效果最好。结论：重组痘苗病毒vJ38gag和vJ38gag-IL-2能够表达外源蛋白并诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。细胞因子IL-2发挥了免疫佐剂的作用。

pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒的构建和表达研究

目的构建PML-RARα融合基因与人白介素-2(hIL-2)基因真核双表达质粒。方法利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过RT-PCR扩增Jurkat细胞中的hIL-2基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点(MCS)A和B中,构建真核双表达质粒。利用酶切和序列分析方法验证所构建质粒的正确性。将构建成功的重组质粒转染A549细胞,通过RT-PCR检测重组质粒在真核细胞中的转录情况,利用点杂交、ELISA检测目的蛋白的表达情况。结果NheⅠ/MluⅠ和SalⅠ/NotⅠ双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hIL-2基因,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将所构建的pIRES-PML- RARα-hIL-2质粒转染A549细胞后经RT-PCR鉴定表明,插入到重组质粒中的PML- RARα和hIL-2基因能够在真核细胞中进行正常转录。经点杂交和ELISA检测显示重组质粒在真核细胞中可表达hIL-2蛋白。结论成功构建了pIRES-PML-RARα-hIL-2质粒,该重组质粒能够在真核细胞中正常转录并表达PML—RARα和hIL-2蛋白。

融合基因mGM-CSF/hIL-2在肝癌细胞瘤苗特异性免疫治疗中的作用

背景与目的:手术切除是治疗肝癌的主要方法,但对其术后的复发转移却无更好的办法。近年来,免疫学的发展使肝癌的治疗有了更好的治疗方法。本研究旨在通过制备人白细胞介素2(hIL-2)与鼠粒-单核细胞集落刺激因子(mGM-CSF)融合基因修饰的H22肝癌瘤苗,观察其特异性抗肿瘤免疫作用。方法:用含hIL-2与mGM-CSF融合基因的真核表达载体,在体外转染H22细胞,制成疫苗,皮下接种小鼠,同时建立荷瘤小鼠模型。用51Cr释放法测定瘤苗免疫组、空载组、未转染组小鼠脾细胞对亲本H22细胞的杀伤活性。取血检测血清中IL-10、IFN-γ水平,观察小鼠存活期。结果:成功制备了含有hIL-2与mGM-CSF融合基因的H22肝癌瘤苗。免疫小鼠脾细胞体外对H22细胞的杀伤率为38.3%,显著高于对S180细胞的9.1%,以及空载组和未转染组的13.6%和7.5%(P<0.05)。转基因瘤苗免疫组血清IFN-γ为(12.83±0.75)pg/mL,较空载瘤苗组的(7.83±0.65)pg/mL明显升高(P<0.01),血清IL-10[(4.58±0.34)pg/mL]较空载瘤苗组的(8.15±0.28)pg/mL明显降低(P<0.01)。同时,转基因瘤苗免疫组小鼠存活期为(40±6)d,较对照组[空载瘤苗组(30±3)d,未转染组(19±4)d]明显延长。结论:转染hIL-2与mGM-CSF融合基因的同系肿瘤细胞瘤苗可激发特异性细胞介导的免疫反应,改善抗肿瘤免疫反应,延长荷瘤小鼠存活期。

重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1对大鼠肾移植存活时间的影响

目的以人IL-2片段与植物毒素Luffin P1重组获得的免疫毒素hIL-2-Luffin P1,观察它对大鼠肾移植排斥反应的抑制作用。方法采用同种异体大鼠肾移植模型,观察hIL-2-Luffin P1对移植物存活的影响,以及移植物的组织病理学观察。结果hIL-2-Luffin P1组大鼠存活时间延长(13.86±2.11)d,与对照组比较相差显著(P<0.01);而Luffin P1处理组与对照组相比无明显差异。同时,病理结果显示对照组移植肾单位结构破坏,淋巴细胞浸润明显,而在同一时间hIL-2-Luffin P1处理组大鼠的移植肾脏病理变化较轻;T淋巴细胞亚群检测显示经hIL-2-Luffin P1处理后,受体外周血T细胞的活化程度降低。结论hIL-2-Luffin P1能够抑制免疫排斥反应,延长移植物存活时间。

PML-RARα-hIL-2 DNA疫苗免疫BALB／c小鼠后胸腺初始T细胞水平变化

目的了解PML-RARα-hIL-2基因疫苗免疫小鼠后胸腺初始(na(?)ve)T细胞变化情况。方法利用实时定量PCR检测小鼠胸腺组织DNA中T细胞受体删除DNA环(TRECs)的水平,从而评价小鼠胸腺中na(?)ve T细胞含量。结果利用PML- RARα-hIL-2 DNA疫苗免疫小鼠后胸腺中所含的TRECs拷贝数明显高于单个基因疫苗PML-RARα或hIL-2组及对照组。结论所构建的PML-RARα-hIL-2双表达质粒可诱导小鼠胸腺产生na(?)ve T细胞数量增加,可能与产生更强的细胞免疫应答有关。

PML-RARα-hIL-2 DNA疫苗诱导BALB／c小鼠的细胞和体液免疫应答

目的分析PML-RARα融合基因疫苗诱导小鼠特异体液和细胞免疫应答情况。方法用成功构建的重组质粒(pIRES-PML-RARα-hIL-2)免疫小鼠后,分别利用ELISA法检测小鼠血清中INF-γ生成情况;LDH释放法检测小鼠脾细胞特异性CTL细胞针对APL细胞株NB4的杀伤率;用间接免疫荧光法检测血清中抗PML-RARα抗体。结果免疫后第7周时,小鼠血清中INF-γ含量、抗PML-RARα抗体及脾脏CTL细胞针对NB4的杀伤率均高于对照组。结论所构建的pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒可诱导小鼠产生了特异性体液和细胞免疫应答。

HIV-1 p24 gag 与hIL-2基因在重组痘苗病毒中的共表达研究

目的：研究 Ｈ Ｉ Ｖ１ｐ２４ ｇａｇ 与 ｈ Ｉ Ｌ２基因在重组痘苗病毒中的共表达。方法：以痘苗病毒复制非必需区血凝素（ Ｈ Ａ）基因为侧翼，将编码人白细胞介素２（ｈ Ｉ Ｌ２）的基因片段克隆到真核表达质粒ｐ１６ Ｑ Ｆ２４ Ｉ Ｌ２，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选，获得了重组痘苗病毒ｖ１６ Ｑ Ｆ２４ Ｉ Ｌ２。结果：经间接免疫荧光试验、 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ 等检测证明，重组病毒能同时表达ｐ２４ ｇａｇ 蛋白和 Ｉ Ｌ２蛋白，表达产物分子量分别为２４ ０００、１６ ０００。结论：这种重组痘苗病毒人表达外源蛋白的成功，为获得更强的免疫效果，研制 Ｈ Ｉ Ｖ 重组病毒活疫苗提供一种安全的新途径。

腺病毒介导hIL-2基因转染膀胱上皮的体内研究

目的:探讨腺病毒介导人IL-2基因转染鼠膀胱移行上皮细胞及其表达的可行性,为膀胱癌的免疫治疗提供实验依据。方法:通过膀胱灌注的方法将重组腺病毒AdhIL-2灌入大鼠膀胱内,分不同时间段获取大鼠膀胱黏膜组织,利用RT-PCR的方法检测hIL-2基因在膀胱移行上皮细胞中的表达。结果:腺病毒介导hIL-2在膀胱移行上皮细胞中得到有效表达,基因表达持续时间达到7天。结论:腺病毒是一种有效介导基因的工具,hIL-2在膀胱上皮细胞中的持续表达为膀胱癌免疫治疗提供新的方法。

HIV-1 env与hIL-2基因在重组痘苗病毒中的共表达研究

以痘苗病毒复制非必需区血凝素（ＨＡ）基因为侧翼，将编码人白细胞介素２（ｈＩＬ－２）的基因片段克隆到真核表达质粒ｐＪ３８ｅｎｖ 的下游，构建成含有ＨＩＶ－１ ｅｎｖ 和ｈＩＬ－２两种外源基因的重组表达质粒ｐＪ３８Ｅ－ＩＬ－２，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选，获得了重组痘苗病毒ｖＪ３８Ｅ－ＩＬ２。经间接免疫荧光试验、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ等检测证明：重组病毒能同时表达Ｅｎｖ 蛋白和ＩＬ－２蛋白，表达产物分子量分别为９８×１０３ 、１６×１０３。

重组免疫毒素hIL-2-LuffinP1对淋巴细胞体外增殖的影响

目的检测基因工程免疫毒素hIL-2-LuffinP1的体外生物学活性。方法采用分离的C57和BALB/c小鼠脾细胞进行混合淋巴细胞反应,刀豆球蛋白A(ConA)刺激BALB/c小鼠脾细胞进行淋巴细胞增殖实验,以LuffinP1毒素分子作为对照。3H-TdR核素掺入法检测hIL-2-LuffinP1对淋巴细胞增殖的抑制作用。以CTLL-2细胞检测hIL-2-LuffinP1对IL-2依赖细胞株的杀伤作用,实验共设6组:PBS、IL-2、LuffinP1、LuffinP1+IL-2、hIL-2-LuffinP1、hIL-2-LuffinP1+IL-2,CTLL-2细胞加入各组试剂培养12h,台盼蓝染色,计数每100个细胞中的死亡细胞数。结果随剂量增加,hIL-2-LuffinP1对淋巴细胞增殖的抑制作用逐渐增强,在10-6mol/L浓度时,抑制率可达到97%,而LuffinP1对淋巴细胞增殖无明显抑制作用。hIL-2-LuffinP1对Con A刺激的脾细胞活化也有抑制作用,与在混合淋巴细胞体系中一致,而LuffinP1对上述两个反应体系中的淋巴细胞增殖均无明显抑制作用。加入hIL-2-LuffinP1+IL-2和hIL-2-LuffinP1后CTLL-2细胞的死亡率分别为29.6%和47.4%,明显高于IL-2组(5.6%,P<0.01)。结论重组免疫毒素hIL-2-LuffinP1在体外能够抑制淋巴细胞增殖,对表达IL-2R的活化淋巴细胞产生定向杀伤作用。

重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2的构建及病毒滴度测定

目的:构建重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2,并测定病毒滴度。方法:从Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-2基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglII和PmeI双酶切定向插入到pAdBM5-GFP腺病毒载体中。通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞,扩增纯化重组腺病毒,TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果:成功构建出表达hIL-2基因的重组腺病毒载体(pAdBM5-GFP-hIL-2),获得了高滴度表达hIL-2基因的重组腺病毒。结论:重组腺病毒表达载体(pAdBM5-GFP-hIL-2)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肝癌的转基因治疗研究。

在重组痘苗病毒中共表达HIV-1env与hIL-6基因

本实验以 HIV- 1env与 h IL - 6基因在重组痘苗病毒中的共表达研究为目的 ,将痘苗病毒复制非必需区血凝素(HA )基因作为侧翼 ,把编码人白细胞介素 6 (h IL - 6 )的基因片段克隆到真核表达质粒 p J38env的下游 ,构建成含有 HIV- 1env与 h IL - 6两种外源基因的重组表达质粒 PJ38E- IL 6 ,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选 ,获得了重组痘苗病毒 v J38E- IL 6。经间接免疫荧光试验、Dot- EL ISA和 Western bolt等检测证明 ,重组病毒能同时表达 env蛋白和 IL - 6蛋白 ,表达产物的分子量分别为 98k Da、2 6 k

HIV-1中国流行株gag-hIL-2重组痘苗病毒与pIRES-gag-hIL-2核酸疫苗联合免疫的实验研究

目的 将HIV 1中国流行株B亚型gag和hIL 2基因在天坛株痘苗病毒中进行共表达 ,与核酸疫苗联合免疫 ,评价免疫效果 ,为新型艾滋病疫苗开发研制奠定基础。方法 将HIV 1中国流行株gag hIL 2基因片段插入到痘苗病毒载体pJ38启动子下游 ,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒 ,SDS PAGE、Westernblot检测目的蛋白。以重组病毒和核酸疫苗免疫BALB c小鼠 ,进行淋巴细胞转化实验及血清抗体的细胞免疫和体液免疫指标检测。结果 获得了重组痘苗病毒vJ38gag IL 2 ,具有更好的免疫原性 ,3rVV效果好于 2rVV ,以 2rVV DNA混合免疫效果最好。结论 重组痘苗病毒vJ38gag IL

抗乳腺癌导向药物-人源化抗p185单链抗体/hIL-2双功能融合蛋白的制备

肿瘤特异性载体结合细胞毒物质构成的导向制剂曾被称为生物"魔弹".抗体作为载体的主体一直是人们研究的重点,虽然仍面临诸多困难,如抗抗体反应及抗体大分子难以穿越微血管壁等,但随着技术进步正逐步得到解决.近年来,用于乳腺癌治疗的Herceptin及用于白血病及胃肠道肿瘤的Gleevec等导向制剂,相继获得FDA批准,已在国内外上市,它们的临床疗效获得了人们的极大重视,显示了良好的应用前景.本文报道一新抗乳腺癌导向药物,即人源化抗原癌基因HER-2/neu(c-erbB2)产物p185单链抗体/人白细胞介素2(hIL-2)双功能融合蛋白的研究工作.