人小肠三叶因子(hITF)基因在生菜中的整合与表达

用根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend )Conn)介导的叶盘法 ,将人小肠三叶因子(hITF)导入生菜 (LactucasativaL .)中 ,在含有除草剂的培养基上筛选 ,获得抗性植株。通过PCR和Southern印迹分析证明 ,hITFcDNA已整合到生菜基因组中。Western印迹分析证明hITF在生菜中的表达。ELISA检测表明 ,hITF在生菜新鲜叶片中的表达量为 2 0 0～ 3 0 0ng/g ,最高达 70 0ng/g ,约占总可溶性蛋白的 0 .1%。

转人小肠三叶因子侧耳中hITF的表达及在大鼠体内生物活性研究

将人小肠三叶因子(hITF)用原生质体法导入糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)中,检测表明,hITF在侧耳新鲜菌丝体中的表达量约为 10 0 0～ 2 0 0 0ng/g,最高约达 2 2 5 0ng/g.体内生物学活性研究证实,口服转hITF侧耳可有效地防止乙醇诱导的大鼠胃溃疡。

人小肠三叶因子在糙皮侧耳中的整合、表达及检测

用原生质体法将含双 35S_AMV启动子及人小肠三叶因子 (hITF)cDNA的表达载体导入糙皮侧耳 (Pleurotusostreatus)中 ,原生质体转化子在含有除草剂的培养基上初步筛选 ,获得抗性菌株。通过PCR分析证明hITFcDNA已整合到侧耳基因组中。以hITF为抗原免疫家兔制备了抗血清 ,纯化后的IgG以直接型酶联免疫吸附检测 (ELISA)方法测定效价 ,并建立起hITF的竞争型酶联免疫吸附检测 (ELISA)方法 ,给出了标准工作曲线 ,以应用于大规模表达菌株的筛选确立。检测表明 ,hITF在侧耳新鲜菌丝体中分 3个表达量段 :10 0 0～ 12 5 0ng g、14 80～ 170 0ng g、最高达2 0 0 0～ 2 2 5 0ng g ,约占总可溶性蛋白的 0 7%～ 1 5 %。Western印迹进一步分析证明hITF在侧耳中的表达。

人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建及稳定整合菌珠的筛选

目的构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体,获得稳定整合酵母菌珠,为大量获得重组hITF、进行功能研究奠定基础。方法通过PCR获得hITFcDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pPICZαA分泌信号下游,得到重组载体pPICZαA-hITF。SacⅠ线性化后氯化锂转化进入X-33,Zeocin筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因,MD、MM鉴定基因型。结果经测序证实PCR扩增的hITFcDNA与基因文库中的完全一致并准确插入酵母表达载体pPICZαA中,氯化锂转化后,PCR鉴定证明重组载体整合进入酵母基因组中,基因型鉴定表明获得的酵母菌株均为Mut+。结论成功构建出酵母表达载体pPICZαA-hITF,获得稳定整合hITFcDNA的酵母菌株,为hITF的大量表达及其功能研究奠定了基础。