hKv4.3基因5＇非翻译区序列S160功能分析

hKv4.3基因是形成瞬时外向钾电流Ito的主要分子基础,它在心脏和神经细胞中大量表达,但在其它组织中则未见大量表达.为了研究hKv4.3表达在基因水平的调节,将hKv4.3基因的5′非翻译区的一段序列(+2^+160,称之为S160)克隆到报告质粒中,进行瞬时表达.发现S160对hKv4.3基因的启动子和SV40的启动子都有强烈的抑制作用,没有方向特异性,但却有位置特异性.经删除突变分析,在S160片段中发现了一个抑制元件S(GAGGGGTTAA),它位于hKv4.3基因中转录起始位点下游20~30bp处.在此基础上,用RT-PCR方法对mRNA进行定量分析,初步确认这个抑制元件对蛋白表达的抑制过程是在翻译水平上.

hKv4.3最小功能启动子区与上游抑制元件分析

通过克隆hKv4.3的启动子区和相关的上游调控元件,对hKv4.3基因在转录水平的调控进行了分析.对启动子区5′端一系列的删除突变分析证明,hKv4.3基因的最小功能启动子区是位于转录起始位点附近的-156～+2bp序列.经序列分析发现,这个启动子缺乏典型的TATA-box,却存在另外3个元件,即E-box(CANNTG),CArG-box[CC(A/T)6GG]和CACC-box(GGTGC),其中CArG-box对该启动子活性起关键作用.同时在启动子区找到一个未见报道的大小为10bp的抑制子T,删除抑制子T,则启动子活性增加1倍以上.

hKv4.3基因中表达调控序列的研究

为研究hKv4.3基因中功能序列对基因表达的影响,我们将hKv4.3基因转录起始位点上游和下游的部分非编码序列克隆到报告质粒pGL2-Basic vector中,瞬时表达,进行荧光素酶相对活性分析。在hKv4.3基因转录起始位点上游和下游的非编码序列中都具有对基因表达具有抑制作用的功能序列,它们可能在不同的水平上对基因表达产生调节作用。

hKv4.3基因中抑制序列功能的研究

目的:研究基因中抑制序列对离子通道基因表达的影响.方法:我们将hKv4.3基因的启动子和5’非翻译区的一段序列(+2^+160,S160)以不同的位置和方向克隆到报告质粒p-βgal-Basic vector中,瞬时表达,进行-βgalactosidase相对活性分析.结果:S160对hKv4.3基因表达具有强烈的抑制作用.结论:抑制序列S160对hKv4.3基因的抑制功能具有位置特异性.