TLN-58和hLYZ基因融合表达载体的构建及其细胞毒性研究

为了评价融合表达抗菌肽TLN-58和人溶菌酶hLYZ双基因重组表达质粒的安全性,试验采用基因重组法将TLN-58和hLYZ基因片段克隆至pEGFP-N1载体,利用转染试剂GeneTwin^(TW)将构建好的重组质粒转染HEK293细胞,RT-PCR验证重组真核质粒在细胞中表达情况;通过DAPI染色、AO/EB染色、CCK-8检测法和流式细胞术测定并分析hLYZ和TLN-58融合基因表达产物的细胞毒性。结果表明:成功构建重组真核质粒pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58,当重组质粒DNA用量为1μg且GeneTwin^(TW)转染试剂用量为3μL时,转染HEK293细胞24 h,为最佳转染条件,重组质粒可成功表达目的基因;DAPI染色和AO/EB染色显示,转染pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58质粒组细胞凋亡与对照组相比,无显著性差异;CCK-8试验测定细胞相对增殖率(RGR)为50%~74%,显示重组质粒的细胞毒性较小;流式细胞术检测发现重组质粒转染细胞与对照组细胞在G1、G2和S期所占的比例均差异不显著。结果表明,重组质粒的细胞毒性较小且对细胞周期无显著影响,为抗菌肽TLN-58和hLYZ的安全性及抗菌应用奠定了研究基础。

人溶菌酶基因的密码子优化设计及生物信息学初步分析

对猪乳蛋白密码子使用偏好性进行了分析,并基于其使用规则,在不改变编码氨基酸序列的基础上对人溶菌酶基因hLYZ的密码子进行了优化设计和生物信息学初步分析。研究结果表明,人hLYZ基因与猪乳蛋白相关基因的密码子使用频率存在明显差异,优化前后猪乳蛋白偏好性hLYZ基因(LYZ-Cas)共改变了109个碱基,约占hLYZ基因碱基总数的24.38%,G+C含量由47.0%下降至43.8%。改造前后hLYZ基因CDS序列所翻译的氨基酸序列比对结果显示,其氨基酸序列没有发生变化,二级结构预测及Nc值计算显示,其能够在猪乳中相对高效表达。本研究旨在分析并比较优化前后hLYZ基因密码子的生物信息学变化,使其在猪乳蛋白中高效表达,对于生产富含人溶菌酶的hLYZ转基因克隆猪具有重要的理论意义,并且对于提高仔猪成活率,防治哺乳动物乳腺炎,提高乳品质等方面具有巨大的应用潜力。