金属硫蛋白-3对dUTPase调节dUTP细胞毒性作用的影响

金属硫蛋白 3(MT 3) ,又称神经生长抑制因子 ,是一种脑特异性金属硫蛋白。人细胞核dUTP焦磷酸酶(dUTPpyrophosphatase,dUTPase)是最近在脑中研究发现的能与人金属硫蛋白 3(humanmetallothionein 3,hMT 3)相互作用的一个蛋白 ,两者共同作用具有神经元生长抑制活性。为了探讨hMT 3对dUTPase调节dUTP引起的细胞毒性作用的影响 ,通过基因转染HEK2 93细胞观察细胞在dUTP中的生长情况 ,发现共转染hMT 3和dUTPase基因的细胞比单转染dUTPase或hMT 3基因的细胞具有更强的对dUTP细胞毒性的耐受能力 ;同时在大肠杆菌BL2 1中表达重组蛋白 ,测定hMT 3在dUTPase水解dUTP中的作用 ,结果显示重组蛋白hMT 3可以促进dUTPase对dUTP的水解。结果均初步证实了hMT 3对dUTPase抵抗dUTP引起的正常细胞死亡有一定的协同作用 ,为进一步研究dUTPase及其相互作用蛋白hMT 3在化疗中的应用提供理论依据。

亲和柱色谱原位酶切法纯化重金属镉结合的金属硫蛋白-3

按照人金属硫蛋白-3(hMT-3)的基因序列,选用大肠杆菌偏爱的密码子合成了全长hMT-3基因,并将其插入大肠杆菌融合表达质粒pALEX的多克隆位点中,在谷胱甘肽-硫-转移酶(G ST)下游与G ST融合表达。通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)LysS中表达了与重金属离子镉结合的融合蛋白G ST-C d2+-hMT-3。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SD S-PAGE)分析表明融合蛋白主要在超声上清液中。分别通过“先纯化、后酶切”和“亲和柱色谱原位酶切”两种方法纯化了C d2+-hMT-3,比较了两种方法的纯化效率和得率,表明原位酶切法操作简便,较之“先纯化、后酶切”法减少了洗脱、透析、冻干等步骤,从而也减少了样品的损失,提高了样品的纯度和得率。从摇瓶培养菌液中纯化获得了结合有C d2+的完整的人金属硫蛋白-3,得率为1.8%。氨基酸组成分析结果表明所获得的C d2+-hMT-3不含芳香族氨基酸和组氨酸,符合金属硫蛋白的特征;直读电感耦合等离子体发射光谱分析其硫镉原子比为21∶(7.5±0.1),与理论值21∶7基本吻合。

镧暴露对子代大鼠学习记忆及海马组蛋白H3K4me3表达的影响

目的探讨镧暴露对子代大鼠学习记忆能力及海马组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)水平的影响。方法将24只SPF级雌性Wistar孕鼠随机分为对照组,2.5、5.0和10.0 g/L氯化镧(LaCl_(3))染毒组,其子代大鼠断乳后通过自由饮水方式按原浓度继续镧暴露。而后在不同时间采用Morris水迷宫实验检测子代大鼠的学习记忆能力,ELISA法测定海马中组蛋白甲基转移酶(HMT)的活性,Western blot法检测海马中H3K4me3和脑源性神经营养因子(BDNF)的蛋白表达水平。结果与对照组比较,出生后第14、21、28、35和49天LaCl_(3)染毒组子代大鼠体质量明显下降(P<0.05)。LaCl_(3)染毒组子代大鼠寻找逃逸平台的潜伏期延长(P<0.05),穿越平台次数和目标象限停留时间均减少(P<0.05),提示子代大鼠空间学习记忆能力受损;与对照组相比,LaCl_(3)染毒组子代大鼠海马HMT活性降低(P<0.05),H3K4me3和BDNF蛋白表达水平均降低(P<0.05),并呈剂量-反应关系。结论镧暴露导致子代大鼠学习记忆能力损伤可能与海马组蛋白H3K4me3表达下降有关。