肝特异性表达hNPC1L1转基因巴马小型猪的获得

利用Fu GENE6将线性化的p Liv-11-Neor/Kanr-h NPC1L1转染至小型猪胎儿成纤维细胞,G418筛选和PCR鉴定结果表明,成功获得了肝特异性表达人尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Human Niemann-Pick C1 Like 1,h NPC1L1)转基因小型猪胎儿成纤维细胞。利用体细胞核移植技术将转h NPC1L1基因小型猪胎儿成纤维细胞作为核供体细胞,获得了肝特异性表达h NPC1L1转基因巴马小型猪,并对转基因巴马小型猪进行了基因组水平、转录水平和表达水平检测,同时对目的基因进行了免疫组化定位分析。结果显示,目的基因特异性地表达于肝组织,并且定位于肝小叶间胆管膜上,表明已成功获得了转h NPC1L1基因巴马小型猪,从而为研究尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1 Like 1,NPC1L1)在肝中作用的分子机制提供了很好的模型动物。

肝过表达hNPC1L1促进脂质过氧化

利用体细胞核移植技术将构建的肝过表达h NPC1L1的小型猪胎儿成纤维细胞作为核供体细胞,构建了肝过表达h NPC1L1转基因巴马小型猪,PCR和RT-PCR鉴定表明h NPC1L1特异性地表达于肝组织。对转基因巴马小型猪进行了初步研究,脂质过氧化标记物丙二醛(MDA)检测表明:转基因猪MDA含量(7.51±0.09)nmol·m L-1显著高于非转基因猪(3.56±0.16)nmol·m L-1(P<0.001),说明肝组织发生了严重的脂质过氧化。超氧化物歧化酶(SOD)活性检测表明:SOD活性为(131±4.61)U·mg-1显著低于非转基因猪[(229.2±4.39)U·mg-1](P<0.001),说明肝脏清除自由基和抗氧化能力大大下降。试验揭示出在肝脏过表达h NPC1L1导致严重的脂质过氧化,表明NPC1L1在脂代谢紊乱和肝脏疾病中扮演着重要的角色,有望成为肝脏疾病治疗新的靶标。

肝过表达hNPC1L1转基因巴马小型猪的初步研究

研究利用体细胞核移植技术构建了肝过表达h NPC1L1转基因巴马小型猪,由PCR和RT-PCR鉴定表明h NPC1L1在肝组织中特异性地表达。我们对转基因巴马小型猪进行了初步研究,对血清和肝匀浆中的TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT和FFA进行了检测,结果表明转基因猪血清FFA(637.7±9.53)μmol/L显著高于非转基因猪血清FFA(540.4±25.46)μmol/L(p<0.01),转基因猪血清AST(200.8±22.31)U/L显著高于非转基因猪血清AST(92.4±15.55)U/L(p<0.01)。另外,我们对肝中与脂代谢密切相关的基因表达情况进行Real-time PCR检测的结果表明,转基因猪SREBP-1c(3.31±0.18,p<0.05)、FAS(4.49±4.21,p<0.01)显著高于非转基因猪。本研究发现NPC1L1在与脂代谢紊乱密切相关的肝脏疾病中发挥着主导作用,它能通过对脂合成相关基因转录的调控,引发脂代谢紊乱以及肝脏疾病。这说明对NPC1L1的研究有望成为治疗肝脏疾病的新靶标。

肝特异性表达hNPC1L1真核表达载体的构建

为进一步研究NPC1L1在代谢性疾病尤其是脂代谢紊乱中具体的分子机制,本研究以pEGFP-C1质粒为模板,通过PCR扩增出Neo^r/Kan^r基因片段,并对pLiv-11质粒和PCR扩增产物进行酶切,用T4DNA连接酶连接Neo^r/Kan^r、pLiv-11和h NPC1L1基因片段,最终构建了含有表达质粒的重组菌株JM109(pLiv-11-Neo^r/Kan^r-hNPC1L1)。酶切鉴定和序列分析结果表明,构建的p Liv-11-Neo^r/Kan^r-hNPC1L1重组质粒含有hNPC1L1(human Niemann-Pick C1 like 1)基因且基因序列和开放阅读框架均正确。本研究成功构建了肝特异性表达hNPC1L1的真核表达载体,为培育h NPC1L1表达转基因巴马小型猪奠定了一定基础,有利于阐释NPC1L1的调控机制以及揭示肝脂肪代谢相关疾病的发病机制。