hPARP-1蛋白缺陷细胞株建立及生长特性

目的建立hPARP-1蛋白缺陷细胞株,观察该缺陷所引起的生物学效应。方法用构建的hPARP-1基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-C1-P)转染人胚肺成纤维细胞(HLF),用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hPARP-1基因的表达水平。同时观察转染细胞生长形态,绘制生长曲线,用流式细胞术观察细胞周期,软琼脂培养法鉴定转染细胞恶性程度。结果pEGFP-C1-P载体在转染细胞内可较稳定表达,hPARP-1蛋白缺陷细胞株hPARP-1基因的蛋白表达水平比HLF下降了47%,比绿色荧光蛋白载体(HLFC)低45%,HLFC比HLF仅少3%。转染后hPARP-1蛋白缺陷细胞生长形态、生长速度无明显变化,软琼脂培养未见细胞集落。hPARP-1缺陷细胞生长形态无明显变化,细胞倍增时间为0.89 d,与HLF细胞0.93 d接近,软琼脂培养未见细胞集落。结论成功建立和鉴定了hPARP-1蛋白缺陷细胞株,在正常生长环境中,该缺陷不足以单独引起可观察的生长特性改变。

hPARP-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆

目的 克隆及构建含限制性内切酶位点BamHⅠ、SacⅠ的人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 1(hPARP 1)基因cDNA翻译起始区域的pGEM T S载体 ,为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料。方法 采用RT PCR方法 ,用正常人胚肺成纤维细胞 (HLF)抽提的总RNA逆转录成cDNA ,再以cDNA为模板 ,扩增hPARP 1基因片段 ,并直接与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5α ,用蓝 (白 )斑试验筛选出阳性克隆 ,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定 ,再行序列分析。结果 经RT PCR获得 5 0 7bp含限制性内切酶位点的阳性产物 ,T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实 ,克隆片段与Genbank中该基因的序列同源性为 99 9%。结论 该实验成功地构建了含hPARP 1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆 。

低剂量氢醌诱导hPARP-1蛋白正常及缺陷细胞适应性反应研究

目的观察人胚胎肺成纤维细胞(HLF)正常及缺陷细胞在低剂量氢醌(hydroquinone,HQ)处理后能否诱导适应性反应,探讨PARP1蛋白缺陷与正常细胞诱导适应性反应与微核形成及细胞周期变化的关系,进一步阐明适应性反应形成机制。方法用低剂量HQ预处理细胞后,观察细胞和DNA对大剂量HQ攻击的适应性反应,从微核率及核异常率、细胞周期等方面测定细胞变化情况。结果在细胞整体活力水平,0.001～0.050μmolLHQ预处理可以提高细胞对攻击剂量80.0μmolL的耐受性;HLF、转染绿色荧光蛋白真核表达载体的HLF(HLFC)和转染hPARP1基因反义RNA真核表达载体的HLF(HLFP)细胞经HQ低剂量预处理及大剂量攻击后,各剂量组不同程度出现含微核和核异常细胞,G1、G2、S期细胞数分布均不相同。与同种细胞仅大剂量攻击比较,0～0.050μmolLHQ预处理的HLF、HLFC及HLFP细胞微核率及核异常率差异均有统计学意义(P<0.05)。HQ预处理的HLF和HLFC细胞均出现G2期阻滞;HLFP细胞表现为G2期阻滞,1.000、2.000μmolL出现G1期阻滞。结论在低剂量HQ作用下,hPARP1蛋白缺陷细胞和正常细胞一样有适应性反应,但低于正常细胞,说明hPARP1蛋白在细胞适应性反应方面起重要作用,适应性反应与细胞周期调控等有关。

hPARP-1高表达HaCaT细胞株的建立

目的建立hPARP-1过表达的HaCaT细胞株,观察过表达该基因后所引起的生物学效应。方法常规提取人皮肤角质细胞HaCaT的总RNA,RT-PCR扩增PARP-1全长cDNA基因片段,构建含PARP-1全长cDNA基因片段的真核表达载体pEGFP-PARP-1,通过BglⅡ、xhoⅠ双酶切及测序鉴定其正确性。利用脂质体将pEGFP-N2和pEGFP-PARP-1分别转染人皮肤角质细胞HaCaT,通过G418加压筛选,建立稳定高表达hPARP-1的HaCaT-PARP-1细胞株,并采用Realtime Q-PCR和Western blotting检测其mRNA和蛋白的表达水平。结果 RT-PCR扩增产物经BglⅡ、xhoⅠ双酶切后,与pEGFP-N2连接构建的重组体经酶切和测序,结果与GeneBank报道序列一致。Realtime Q-PCR及Western blotting结果显示,转染pEGFP-PARP-1质粒的细胞其PARP-1在mRNA及蛋白的表达水平均显著高于对照组。结论 PARP-1高表达细胞株成功建立。