siRNA介导的hPOT1基因表达抑制对HeLa细胞凋亡的影响

目的 应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,特异地抑制端粒保护蛋白hPOT1基因在HeLa细胞中的表达,并观察其对细胞凋亡的影响。方法利用先前构建的含hPOT1基因特异性序列(hsRNA)的3种重组siRNA表达质粒,由脂质体介导转染HeLa细胞,以RT PCR和电泳迁移率变化分析法检测转染细胞中的hPOT1基因的表达抑制效果,并通过流式细胞术、Hoechst荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果 不同hPOT1特异性序列的3种的重组质粒转染HeLa细胞4 8h后,细胞中hPOT1基因mRNA和蛋白质表达水平降低,细胞凋亡水平明显增加。结论 siRNA表达载体介导的RNAi能有效地抑制HeLa细胞中hPOT1基因表达。

TRF1及hPOT1 mRNA在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

目的检测端粒重复序列结合因子1(TRF1)和端粒保护蛋白1(hPOT1)在鼻咽癌组织中的表达,探讨其在鼻咽癌发生过程中的作用及其临床意义。方法应用荧光定量RT-PCR检测47例鼻咽癌组织和10例正常鼻咽部黏膜组织中TRF1及hPOT1的mRNA表达水平。结果①鼻咽癌组织中TRF1 mRNA的表达明显低于正常鼻咽部黏膜组织(P=0.027),hPOT1的mRNA表达强度明显高于正常鼻咽部黏膜组织(P=0.013)。②TRF1 mRNA的表达与鼻咽癌T分期相关(P=0.038),但与临床分期和有无颈部淋巴结转移无明显相关(P>0.05)。③鼻咽癌组织中hPOT1 mRNA的表达与鼻咽癌临床分期、T分期和有无颈部淋巴结转移相关(P=0.013,P=0.025,P=0.041)。④鼻咽癌组织中TRF1 mRNA与hPOT1 mRNA的表达呈负相关(r=-0.461)。结论鼻咽癌组织中TRF1 mRNA的表达下降可能与鼻咽癌的发生相关,hPOT1 mRNA的表达增强可能与鼻咽癌的发生和发展相关。

人端粒保护蛋白hPot1的一种新选择性剪接体的克隆及鉴定

hPot1是端粒单链结合蛋白,在维持染色体末端的稳定性中发挥着重要作用。从前列腺癌细胞C4-2中提取总RNA,以反转录得到的cDNA为模板,扩增全长的hPot1cDNA,发现hPot1基因的一种新的剪接形式。这种新的剪接形式缺失了野生型hPot1基因的第2个外显子,并且造成了读码框架的改变,使翻译提前终止,表达出一段有45个氨基酸残基的短肽。进一步检测表明,这一hPot1mRNA新剪接体广泛存在于多种组织来源的细胞中,提示这一剪接形式可能是细胞调控hPot1功能的一种调节机制。

人端粒保护蛋白1(hPOT1)研究进展

随着对端粒、端粒酶研究的深入,一类被称为端粒结合蛋白的核蛋白越来越受到重视。人端粒保护蛋白1(human protection of telomeres 1,hPOT1)及其基因在2001年被鉴定,它是一种单链端粒结合蛋白,有两大功能相关结构域:OB fold(oligonucleotide/oligosaccharide binding fold)和TRF1(TTAGGG repeatbinding factor 1)相互作用蛋白结构域。它与端粒DNA的结合具有高度特异性和对单链端粒DNA游离3′末端结合位点的优先性。hPOT1蛋白可能具有多种重要的功能。目前有关hPOT1蛋白的研究越来越多,现就hPOT1的生物学性质作一综述。

胃癌hPOT1基因单核苷酸多态性与幽门螺杆菌感染的关系

目的探讨胃癌中人端粒保护蛋白1基因(hPOT1)IVS13-98G/T位点单核苷酸多态性与幽门螺杆菌(H.pylori)感染的关系。方法采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)对150例外科手术切除的胃癌患者和156例正常对照者行基因型分析,采用PCR和Warthin-Starry银染色法检测幽门螺杆菌。结果胃癌组hPOT1IVS13-98 T/G位点GG、GT、TT基因型的频率分别22.00%、41.67%、36.67%,G、T等位基因频率分别为42.67%、57.33%;对照组GG、GT、TT基因型的频率分别为24.36%、51.92%、23.72%,G、T等位基因频率分别为49.68%和50.32%。两组G、T等位基因型频率比较无统计学意义(2χ=3.0257,P=0.0820)。以T/T基因型作为参照基因型,G/T和G/G两种基因型OR值分别为0.432(95%CI:0.242-0.772,P=0.005)、0.540(95%CI:0.274-1.064,P=0.075)。胃癌中3种基因型H.pylori的检出率无统计学意义(P>0.05)。结论hPOT1 IVS13-98G/T单核苷酸多态性可能与甘肃胃癌高发区的胃癌患者有关,可能为胃癌的保护因素。胃癌hPOT1 IVS13-98G/T单核苷酸多态性与H.pylori感染无关。

人端粒保护蛋白1(hPOT1)保护和调节端粒长度机制

人端粒保护蛋白1(humanprotectionoftelomeres1,hPOT1)是一种端粒单链DNA结合蛋白,与端粒单链TTAGGG重复序列特异性结合。hPOT1蛋白分子有其特有的结构,其与TTAGGG重复单链序列的结合具有独特的分子机制。hPOT1与其他重要的端粒结合蛋白、端粒酶等相互作用,共同完成端粒保护和端粒长度调节。

食管鳞癌组织中hPOT1蛋白的表达及其意义

目的检测食管鳞癌组织、切缘组织及癌旁组织中hPOT1蛋白的表达水平,探讨它们之间的关系及鳞癌组织中hPOT1的表达与肿瘤临床病理学参数的关系。方法采用免疫组织化学技术检测上述组织中hPOT1蛋白的表达水平。结果82例鳞癌组织、切缘组织中,hPOT1蛋白阳性表达率分别为78.05%(64/82)、73.17%(60/82)两者相比差异无统计学意义(P>0.05),51例癌旁组织中hPOT1蛋白阳性表达率为50.98%(26/51),与鳞癌组织相比差异有高度统计学意义(P<0.01)。hPOT1蛋白的表达与患者的性别、年龄及肿瘤的大小、分化程度没有相关性(P>0.05),与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及患者生存期密切相关,有统计学意义(P<0.05)。结论hPOT1蛋白的表达与食管鳞癌的发生、发展有密切的关系,检测hPOT1蛋白的表达对判断食管鳞癌预后有一定的指导意义。

hPOT1基因正反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人端粒保护蛋白(humanprotectionoftelomeres,hPOT1)基因的正、反义真核表达载体,以进一步研究hPOT1蛋白的功能及作用机制。方法用限制性内切酶将hPOT1cDNA从pLPCNMycPOT1质粒上切下来,经适当改造后以正、反方向插入到质粒pcDNA3.1(-)中,构建hPOT1基因的正、反义真核表达载体;用PCR、酶切及DNA测序的方法鉴定hPOT1基因正、反义表达载体序列和方向的正确性。结果PCR、酶谱分析及DNA测序结果表明hPOT1正、反义真核表达载体序列和方向正确。结论成功地构建了hPOT1正、反义真核表达载体,为进一步研究hPOT1在端粒保护、细胞衰老和凋亡中的作用奠定了基础。

siRNA介导hPOT1基因表达抑制对HeLa细胞Caspase-3的影响

目的应用siRNA表达载体介导的RNA i技术,特异地抑制端粒保护蛋白POT1基因在HeLa细胞中的表达,并观察其对细胞Caspase-3活化的影响。方法利用作者课题组先前构建的含hPOT1基因特异性序列(hsDNA)的3种重组siRNA表达质粒(pmU6-shRNA1、pmU6-shRNA2和pmU6-shRNA3),由脂质体介导转染HeLa细胞,以RT-PCR和EM-SA法检测转染细胞中的hPOT1基因的表达抑制效果,并通过RT-PCR、W estern b lot和Caspase-3检测试剂盒分析Caspase-3表达和活化。结果3种pmU6-shRNA重组质粒转染HeLa细胞48 h后,细胞中hPOT1基因mRNA和蛋白质表达水平均降低,Caspase-3 mRNA表达水平基本无变化,Caspase-3酶原水平降低,而Caspase-3酶活性增高。结论siRNA表达载体介导的RNA i能有效地抑制HeLa细胞中hPOT1基因表达,hPOT1基因表达的抑制导致细胞Caspase-3活化。

hPOT1基因过表达对HeLa细胞细胞周期和凋亡的影响

目的观察人POT1(protectionoftelomeres1)基因过表达对HeLa细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。方法利用本课题组构建的hPOT1基因真核表达重组质粒pcDNA3-hPOT1,经脂质体介导瞬时转染HeLa细胞;通过RT-PCR和EMSA法(电泳迁移率改变分析)检测外源基因的表达效果,流式细胞术分析细胞周期,Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡。结果pcDNA3-hPOT1重组质粒转染HeLa细胞48h后,mRNA和蛋白质分析表明,外源性hPOT1基因能在HeLa细胞中有效表达,HeLa细胞阻滞于细胞周期S期,而对凋亡无明显影响。结论hPOT1基因可能参与了高等真核细胞细胞周期调控过程,但与细胞凋亡无密切关系。

载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白(hPOT1)基因的短链干扰核糖核酸(siRNA)表达载体,观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用,为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1siRNA基因片段的寡核苷酸,退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1RNA启动子下游,构建psiRNAhPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导的基因转染方法,转入SGC7901胃癌细胞,用半定量RTPCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNAhPOT164个碱基成功插入到预定位置,并且序列完全一致。hPOT1siRNA表达载体psiRNAhPOT1转入胃癌细胞后,可明显抑制SGC7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNAhPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC7901胃癌细胞中的表达。

端粒单链结合蛋白hPOT1核定位结构域的鉴定

目的 :鉴定端粒单链结合蛋白hPOT1核定位结构域。方法 :通过hPOT1的不同长度缺失突变体与EGFP绿色荧光蛋白融合 ,转染细胞后用荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的定位。结果 :确定了hPOT1进核序列是定位于第 35 5～ 375位氨基酸之间的富含碱性氨基酸序列 ,其中R3 72 ,R3 73 影响hPOT1的细胞核内定位。结论 :鉴定出hPOT1的核定位结构域 ,该结构域影响了hPOT1不同形式剪接体蛋白的细胞内分布。为进一步研究hPOT1在端粒末端调控中的作用提供了线索。

人pot1基因cDNA的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的:克隆人端粒保护蛋白(hum an protection of telom eres 1,p ot1)基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在H eL a细胞中的表达。方法:RT-PCR法扩增出H eL a细胞hp ot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA 3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA 3-hp ot1质粒瞬时转染H eL a细胞,RT-PCR和EM SA法(电泳迁移率改变分析)检测hp ot1基因的表达水平。结果:来自H ela细胞的hp ot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA 3-hp ot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在H eL a细胞48h后,hp ot1基因表达水平增高。结论:真核表达载体pcDNA 3-hp ot1构建成功,并实现了hp ot1在H ela细胞中的表达。

人端粒保护蛋白在胃癌中的异常表达及其临床意义

目的探讨人端粒保护蛋白(humanprotectionoftelomeres,hPOT1)在胃癌中的异常表达及其临床意义。方法用SP免疫组化方法检测hPOT1在57例胃癌标本中的表达,同时以10例正常胃黏膜标本做对照。结果57例胃癌标本的表达全阳性,阳性率100%,显著高于正常胃黏膜hPOTl的表达(40%)。浸润至或超过浆膜层的胃癌hPOT1表达强度显著高于未达浆膜层者,Ⅲ/Ⅳ期胃癌明显高于Ⅰ/Ⅱ期胃癌,低分化胃癌高于高分化胃癌(P<0.05)。结论hPOT1在胃癌组织中表达异常增高,提示hPOT1与胃癌的发生、发展有密切的关系,检测hPOT1的表达可能会有助于胃癌的早期诊断和预后。

人端粒保护蛋白的研究进展

人端粒保护蛋白(human protection of telomeres,hPOT1)是一种端粒单链DNA结合蛋白,它结合于端粒末端的单链重复序列,在端粒长度的调控以及染色体的稳定方面起重要的作用。其表达水平下降所引起的端粒功能异常以及染色体畸变,与人类细胞的老化和恶性肿瘤的发生发展有密切的关系。对hPOT1结构、功能及作用机制的研究,不但可以进一步阐明细胞衰老和恶性肿瘤发生的分子机制,而且也将为肿瘤的诊断、治疗开辟新的思路和方法。