电离辐射对人乳腺癌MCF7细胞系hR24L基因表达的影响

目的 :研究电离辐射对人类DNA修复基因hR2 4L表达的影响。方法 :通过RT -PCR从人乳腺癌MCF7细胞总RNA中扩增hR2 4L的开放阅读框 (ORF) ,经测序无突变后用γ射线照射细胞。照射后不同时间收集细胞 ,提取总RNA ,用Northern印迹杂交分析hR2 4L表达变化。结果 :hR2 4L基因的转录在电离辐射后 1h后开始上升 ,2h达高峰 ,3h恢复正常。结论 :该基因的表达具有损伤诱导性特点 ,对γ射线损伤有修复作用。

HeLa细胞中hR24L基因的表达、DNA损伤修复、G_2/M阻滞与电离辐射之间的关系(简报)

DNA是生命活动中最重要的遗传物质,保持其分子结构的完整性对于细胞至关重要,因此研究DNA损伤修复是生命科学的重要课题之一.基因组比较简单,易于操作的单细胞真核生物酵母遂成为研究DNA损伤修复的重要材料.对紫外线或电离辐射敏感的酵母突变株称为rad突变株.酵母细胞的基因组中有近30个遗传位点与辐射抗性有关.根据单突变和双突变的敏感特征所得出的上位关系可将其分为3个上位显性组[1,2]:RAD3组,该组成员参与核苷酸的切除修复,其突变株对紫外线敏感;RAD6组,参与复制后修复,其突变株对化学诱变剂敏感;RAD52组,参与重组修复(包括链断裂修复),其突变株对电离辐射敏感.RAD24基因属于RAD3组,兼有其他组的某些特性.

HR24L基因过表达抑制细胞凋亡

目的 :研究人类DNA损伤修复基因HR2 4L与细胞凋亡的关系。方法 :PCR方法扩增HR2 4L基因开放阅读框序列 ,克隆入逆转录病毒载体pDOR neo ,转染HeLa细胞 ,筛选阳性克隆 ;Southern印迹验证HR2 4L基因的整合状况。Northern印迹检查HR2 4LmRNA的细胞内表达水平。过氧化氢、丁酸钠及血清饥饿诱导凋亡 ,流式细胞计数仪检测凋亡比例 ,电泳观察DNALadder,Western印迹检测凋亡相关蛋白质的表达。结果 :获得转染有HR2 4L基因的HeLa细胞。与HeLa细胞相比 ,HeLa HR2 4L细胞HR2 4LmRNA表达明显上升。HR2 4L基因过表达导致Bcl 2的表达升高 ,抑制caspase 3和Bax的表达 ,而对p53却无明显的影响。HR2 4L基因过表达抑制过氧化氢和血清饥饿诱导的细胞凋亡 ,但对丁酸钠诱导的细胞凋亡却无抑制作用。结论 :HR2 4L基因过表达抑制细胞凋亡。

HR24L基因编码的蛋白质定位于细胞核内并参与细胞周期的调节

目的:研究HR24L基因编码的蛋白质在细胞内的定位及其对细胞周期的影响。方法PCR方法扩增HR24L开放阅读框序列,克隆入绿色荧光蛋白载体pEGFPC2和逆转录病毒载体pDORneo,分别经脂质体介导转染入HeLa细胞。荧光显微镜观察HeLaGFPHR24Ls细胞,Southern印迹杂交分析外源性HR24LcDNA的整合状况。去血清处理细胞,观察HR24L基因对细胞周期的影响。Western印迹分析HR24L基因对p53表达的影响。结果转染获得了HeLaGFPHR24L、HeLaHR24Ls和HeLaHR24La细胞。荧光显微镜观察证实HR24L编码的蛋白质位于核内。Southern印迹分析证实HeLaHR24Ls和HeLaHR24La细胞中外源性HR24LcDNA已整合入基因组。与对照和空载体细胞相比,HeLaHR24Ls细胞中HR24LmRNA表达升高,HeLaHR24La细胞中HR24LmRNA表达降低。经过24h去血清培养后,HeLaHR24Ls细胞中G2/M期细胞明显较其他细胞增多(P<0.05),其他3种细胞则无明显差别。重新加入血清培养后24h这种差别消失。Western印迹分析表明,HR24L基因对p53的表达无明显影响。结论HR24L基因编码的蛋白质位于细胞核内且参与细胞周期的调节。

hR24L基因转染对MCF7细胞周期的影响

目的 通过观察人类DNA损伤修复基因hR2 4L转染对MCF7细胞增殖周期的影响 ,进一步了解其功能及作用机制。方法 分别用正义和反义hR2 4L逆转录病毒表达载体(pDor-neo)重组体转染MCF7细胞 ,观察细胞生长速度 ,用Northern印迹杂交检测hR2 4L基因的表达情况 ,并用流式细胞仪检测细胞周期。结果 与转染空载体的细胞相比 ,转染正义hR2 4L重组体的细胞生长较慢 ,其hR2 4LmRNA的表达增加 ;而转染反义hR2 4L重组体的细胞生长较快 ,其hR2 4LmRNA的表达则降低 ;转染后 6h流式细胞仪检测表明 ,转染正义hR2 4L重组体的细胞G2 +M期的比例 (18% )明显高于其它 3种细胞 (6 % )。结论 hR2 4L基因的表达抑制了细胞生长 ,其机制是引起细胞周期阻滞 ,参与细胞周期调控。

hR24L基因的克隆及逆转录病毒重组体的构建

目的 克隆人类DNA损伤修复基因hR2 4L ,并构建逆转录病毒表达载体重组体 ,为进一步研究该基因的功能及作用机制奠定基础。方法 用PCR法扩增hR2 4L基因的开放阅读框 (ORF) ,然后连接到 pEGM -T载体中 ,经测序验证无突变后 ,再重组到逆转录病毒表达载体 (pDor -neo)中 ,得到正义和反义重组体。 结果 建立了一种有效的基因克隆方法 ,成功地克隆了hR2 4L基因 ,获得了含有重组体的稳定遗传的细胞株。结论 PCR法是克隆hR2 4L基因的有效方法 。

hR24L基因转染对MCF7细胞凋亡的影响

为研究人类DNA损伤修复基因hR2 4L与细胞凋亡的关系 ,首先用PCR方法扩增了hR2 4L基因的开放阅读框(ORF) ,成功地构建了正义和反义hR2 4L基因的逆转录病毒表达载体重组体。然后用这两种重组质粒转染MCF7细胞 ,筛选出的阳性克隆再分别用过氧化氢、丁酸钠和去血清饥饿诱导凋亡 ,用Northern印迹杂交分析hR2 4L基因表达情况 ,用流式细胞仪和电泳检测细胞凋亡。结果发现转染正义hR2 4L重组载体的细胞的hR2 4LmRNA表达水平升高 ,其凋亡面积所占比例 (2 1 2 1± 2 42 )比对照细胞 (46 16± 4 38)明显降低 ;而转染反义hR2 4L重组载体的细胞的hR2 4LmRNA表达水平则下降 ,但其凋亡峰面积所占比例 (31 0 5± 3 0 2 )比对照细胞也明显降低 ,表明两者均抑制过氧化氢和去血清饥饿诱导的凋亡 ,但它们对丁酸钠诱导的凋亡均无抑制作用。可见hR2

辐射损伤诱导HR24L多种修复蛋白复合物的形成

目的 探讨辐射损伤后HR2 4L修复蛋白复合物的形成 ,为HR2 4L参与切除修复和重组修复提供生化证据。方法 利用质粒共转染和免疫共沉淀技术检测HR2 4L复合物中关键修复蛋白的存在及其在辐射损伤后的变化。结果 2 0J m2 紫外线照射损伤后 2h ,可检测到HR2 4L ,复合物中存在有XPA。 2 0Gyγ射线照射后 2h ,检测到Ku70参与HR2 4L复合物的形成 ,照射后 8h可见Rad5 2存在。结论 辐射损伤后 ,切除修复蛋白和重组修复蛋白参与HR2 4L复合物形成的生化证据 ,进一步支持HR2 4L参与多种修复途径的论点。

异染色质蛋白HP1α参与辐射损伤修复的研究

目的 研究HP1α对辐射损伤修复的影响。方法 用反义技术单独抑制HP1α和联合抑制HR2 4L表达 ,观察细胞对辐射敏感性的影响 ,用免疫共沉淀法观察HP1α是否参与修复蛋白复合物的形成。结果 单独抑制HP1α,细胞对辐射敏感性与正常细胞相比差异无显著性 ,联合抑制HP1α和HR2 4L时 ,细胞对辐射的敏感性比单独抑制HR2 4L时显著增加 ;2 0Gyγ射线照射后 8h ,可检测出HR2 4L与HP1α复合物的存在。结论 HP1α与修复蛋白相互作用 ,参与DNA损伤修复 ,从而影响细胞对辐射的敏感性。