表达反义hREV3基因片段的真核细胞表达质粒的构建

目的：构建真核细胞表达重组体，为今后利用反义核酸阻断技术研究ｈＲＥＶ３ 基因功能及其与细胞遗传不稳定性的关系提供物质材料。方法：用内切酶Ｂａｍ ＨＩ及Ｂａｍ ＨＩ＋ Ｈｉｎｄ Ⅲ分别对ｐＢＳ－ ｈＲＥＶ３ 进行单酶切和双酶切，从而得到含ｈＲＥＶ３ ｃＤＮＡ 特异性保守序列的两种长度（７４２ｂｐ 和３５７ｂｐ） 片段，分别将两者插入真核细胞表达载体：ｐＢＫ－ＲＳＶ（ 持续表达载体） 和ｐＭＡＭｎｅｏ ａｍｐ － （ 表达需经地塞米松诱导） 。结果：经酶切图谱分析，筛选出含正向和反向插入片段真核细胞表达重组体５ 种。结论：为深入研究ｈＲＥＶ３

hREV3基因表达被反义阻断的人胚肾细胞系的建立及其某些生物学特性观察

目的：建立 ｈＲＥＶ３基因表达反义阻断的细胞系并观察其生长特性与对烷化剂 Ｎ－甲基－Ｎ’－硝基－Ｎ－亚硝胍（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－ｎｉｔｒｏ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，ＭＮＮＧ）敏感性的改变。方法：利用改良磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀法分别将本室构建的持续和诱导表达反义ｈＲＥＶ３ ＲＮＡ的真核细胞重组表达质粒ｐＢＫ－ＲＳＶ－ｈＲＥＶ３和ｐＭＡＭｎｅｏ－ａｍｐ－－ｈＲＥＶ３转染人胚胎肾细胞（ＨＥＫ－２９３细胞），经Ｇ４１８筛选，建立相应的细胞系２９３－Ｂ－ｈＲＥＶ３－和２９３－Ｍ－ｈＲＥＶ３。通过细胞计数方法观察这些细胞系的生长速率和不同浓度ＭＮＮＧ对细胞的细胞毒作用。结果：持续或诱导阻断ｈＲＥＶ３基因的表达对细胞生长速率均无影响；反义阻断细胞系对ＭＮＮＧ的细胞毒作用比母本２９３细胞较为敏感。结论：ｈＲＥＶ３基因的编码产物并非细胞生长所必需而可能在细胞的ＤＮＡ损伤修复中起作用。

hREV3基因对细胞增殖周期的影响

应用反义阻断REV3基因表达的人胚肾上皮细胞（HEK-293-M-REV3-）来研究人类REV3基因对细胞增殖周期的影响，评价该基因在哺乳类细胞突变形成中的作用，探讨其与肿瘤形成的关系。文章应用流式细胞技术分别对在自发或不同理化诱发条件[（紫外线，UVB）和（甲基甲烷磺酸酯，MMS）]下，对体外培养的HEK-293-M—REV3-细胞进行细胞增殖周期和DNA含量的影响进行检测，并计算细胞的增殖指数。结果显示：自发状态下，HEK-293-M—REV3-细胞与对照组细胞相比S期延长；而UVB和MMS不同理化因素诱导时，HEK-293-M—REV3-细胞的G2-M期或S期比例明显比对照组增加，PI值也相应增加。因此可以推测，当REV3基因低表达时，细胞无论在自发还是诱发情况下突变频率均降低，原因可能与细胞周期的改变有关，进而再引起DNA复制叉阻滞、合成减少，导致细胞死亡或凋亡。

反义阻断hREV3基因表达对细胞生长及MNNG敏感性的影响

目的 :应用反义核酸阻断技术研究hREV3基因对细胞生长和MNNG敏感性的影响。方法 :酶切法构建表达反义hREV3基因片段的真核细胞表达质粒 ;以改良的磷酸钙 -DNA共沉淀法建立hREV3基因表达被阻断的人胚肾细胞 (2 93细胞 )细胞系 (2 93 -hREV3-)。以细胞记数方法检测该细胞系的生长速率及不同浓度的烷化剂MNNG对细胞的毒作用。结果 :hREV3基因表达被阻断的人胚肾细胞 (2 93-hREV3-)与对照组母本 2 93细胞和转染载体DNA的 2 93细胞相比在生长速率上无明显差异 ,但对烷化剂MNNG的细胞毒作用较为敏感。结论 :hREV3基因编码蛋白并非细胞增殖所必需 。