定量RTPCR中人干细胞因子的RNACRS的构建

一种适用于定量RT PCR、用ExonucleaseⅢ部分酶切剔除技术 ,构建人干细胞因子 (hSCF)基因的RNA竞争性参考标准 (RNA CRS)的新方法 :用RT PCR技术 ,从HepG2细胞中扩增出全长人hSCFcDNA ,并克隆入质粒pGEM T获重组的pGEMSCF载体 ,经ExonucleaseⅢ和S1核酸酶适当处理 ,以导致hSCFcDNA中一小片段缺失 ,由此获得重组 pGEMSCF模拟体 (mimic) ,经体外转录得到hSCFRNA CRS .测序表明 :该RNA CRS与hSCFmRNA比较 ,缺失了从第 4 99位至 60 8位共 110个核苷酸 ,但二者RT PCR反应可用同一对扩增引物 ,反应动力学极为相似 .这种hSCFRNA CRS可作为一种较理想的竞争性参考标准 ,适用于定量RT PCR中 ,以对重组hSCF在真核细胞中的表达水平进行准确的定量分析 .此方法亦可推广应用于其他真核基因的表达水平及

干细胞因子的研究及其应用

人干细胞因子 (hSCF)是新近发现的重要造血细胞因子 ,它是酪氨酸激酶受体c Kit的配体。SCF主要作用于早期造血干细胞、原始造血祖细胞 ,并且诱导这些细胞的存活、增殖和分化。SCF单独使用生物学作用低 ,但它与其它细胞因子具有强的协同作用。在临床Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期研究中 ,SCF和G CSF联合应用 ,与单独使用G CSF比较 ,CD34+ 细胞数增加 2～ 3倍。安进公司采用基因重组技术在大肠杆菌中生产的重组人SCF (r methSCF )商品名为STEMGENTM。SCF临床使用 ,包括体内干细胞扩增治疗 (exvivo)和用于基因治疗的体外培养造血干细胞。SCF与G CSF联合使用刺激扩增外周血干 祖细胞 (PBPC) ,可用于干 祖细胞移植 ,以增加患者所需PBPC的比例 ,减少收集PBPC的次数。本综述主要介绍了人SCF的功能 。

人干细胞因子cDNA的设计、合成与克隆

选择大肠杆菌的偏爱密码子,分成18个长约60个碱基且相互配对的寡核苷酸片段,合成了可溶形式的人干细胞因子(hSCF)的cDNA。合成片段经纯化、5'-端磷酸化后,通过PCR进行合成hSCF的cDNA一次性组装与扩增,得到了含有可溶形式的hSCF的全部编码区及EcoRⅠ、SalⅠ位点在内的全长共515个碱基对的DNA片段。回收该DNA片段,酶切消化,定向克隆进质粒pUC19。经酶切鉴定以及序列测定,得到了全序列正确的克隆株,为下一步的工作奠定了基础。

重组人干细胞因子

选择大肠杆菌的偏性密码，合成了可溶形式的人干细胞因子（ｈＳＣＦ）的ｃＤＮＡ。通过ＰＣＲ完成了合成片段的一次性组装与克隆，并在Ｅ．ｃｏｌｉ中进行了温控型的高效表达，目的蛋白可占菌体总蛋白的４０％左右。表达产物复性后，经离子交换、凝胶过滤层析，得到了电泳纯的ｒｈＳＣＦ。经测定，ｒｈＳＣＦ氨基端序列及其它理化性质与天然ｈＳＣＦ完全一致，并可刺激人骨髓细胞的增殖，导致粒、巨核系集落（ＣＦＵ－ＧＭ）大小、数量的明显增加，显示天然ｈＳＣＦ的生物活性。

可溶型人干细胞因子cDNA的克隆表达、复性与纯化

目的 :构建可溶型人干细胞因子 (hSCF)基因的表达载体。优化培养条件 ,实现hSCF基因在大肠杆菌中的高表达。方法 :利用PCR技术 ,以人淋巴结cDNA为模板扩增并克隆hSCF基因。用简并PCR对hSCF基因 5′端的序列进行修饰 ,以实现在大肠杆菌中的高效表达 ;用MTT比色法测定初步复性和纯化的hSCF蛋白的生物学活性。结果 :扩增并克隆了hSCF成熟肽cDNA。将其插入表达载体pBV2 2 0构建了hSCF基因的表达质粒 ,并在大肠菌中初步表达。表达量占总菌体的 2 0 %以上 ,优化培养条件后表达量可达到 4 0 %以上 ,表达产物为包涵体。将包涵体溶解在 8mol/L脲或 7mol/L盐酸胍中 ,用疏水色谱法进行复性并同时纯化 ,得到具有天然生物学活性的rhSCF蛋白。结论 :成功地克隆hSCF基因 ,并实现在原核系统中的高表达 ,所获表达菌株可用于生产以获得具有生物学活性的rhSCF蛋白产品。

考虑钢-砼接触特征的CFST管节点热点应力分析

为研究不同钢-砼界面接触特征下钢管混凝土桁架焊接管节点局部应力分布及热点应力集中系数,以钢管混凝土桁架Y型焊接管节点(主管与支管夹角θ=60°)为研究对象,利用ANSYS有限元软件,选择其Solid45、Mass21、Targe170和Conta173单元建立管节点有限元模型,引入非线性面-面接触关系模拟局部变形导致的钢管与内填混凝土之间发生的相互挤压或脱离,计算得到钢管与内填混凝土接触间隙、侵入深度、法向接触应力和切向摩擦应力等局部接触变形及应力状态。分析了3种摩擦系数下(0、0.35、0.60),主管及支管的热点应力集中系数(HSCF)分布。研究结果表明:主管焊趾处热点应力HSCF在冠跟处出现最小值,在鞍点和冠趾之间的中点出现最大值;与主管相比,支管HSCF总体较小,冠跟处出现最小值,鞍点和冠趾之间出现最大值。支管轴向拉力作用下,Y型管节点焊缝附近钢、砼相互脱开,冠点附近比鞍点附近脱空区域大,鞍点脱空区域外围是钢管和混凝土接触挤压最剧烈区域,接触法向压力最大,混凝土对钢管支撑作用最明显。摩擦系数对管节点热点应力集中系数分布趋势影响很小,对HSCF最大值有一定影响。

可溶性人干细胞因子的原核表达和纯化

用Trizol提取人骨髓总RNA,通过RT PCR扩增人干细胞因子DNA,克隆到pMD18 T载体中并测序将其定向连入原核表达载体pET32a(+),获得了重组表达载体pET32a(+)/hSCF,其cDNA长度为504bp,测序结果与已知序列吻合然后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,获得37kD的融合蛋白,约占菌体总蛋白量的30% 经Ni2+