蛋白hSav1和Mst1之间的相互作用

目的探讨hSav1(human salvador1)和Mst1(Mammalian STE20-like 1)存在的相互作用,为进一步研究Mst1的功能及相关机制奠定基础。方法以Mst1cDNA全长构建诱饵蛋白载体pGBKT7-Mst1,并对其自身转录活性进行鉴定,利用酵母双杂交系统筛选人胎肝文库,挑选单克隆,从而初步筛选出与Mst1相互作用的蛋白。然后构建初步筛选出的蛋白hSav1的载体pCMV-HA-hSav1,与蛋白Mst1的载体pcDNA/4TO-Flag-Mst1共转染HEK293T细胞,利用相应抗体做二者的免疫共沉淀,以验证蛋白hSav1和Mst1之间的相互作用。其次构建pEGFP-hSav1质粒转染HEK293T,利用免疫荧光观察二者在细胞内的定位。结果以Mst1为诱饵蛋白在人胎肝文库筛选到包括hSav1在内的与之存在相互作用的蛋白。免疫共沉淀结果显示,hSav1蛋白可以在FLAG抗体的免疫沉淀物中检测出来,同样在hSav1抗体的免疫沉淀物中也能检测到蛋白Mst1。免疫荧光的结果显示二者荧光在细胞内存在共定位,二者的荧光可充分融合。结论蛋白hSav1与Mst1在哺乳细胞内存在某种相互作用,为进一步研究Mst1的功能及相关机制提供了线索。

hSav1蛋白高表达对Mst1介导的细胞凋亡的影响

目的观察hSav1蛋白高表达对Mst1介导的细胞凋亡的影响，探讨hSav1在Mst1介导的细胞凋亡中的作用。方法构建蛋白hSav1的载体pCMV—HA—hSav1与蛋白Mst1的载体pcDNA／4TO—Flag-Mst1，共转染HeLa细胞。采用相应抗体做二者的免疫共沉淀，以证实蛋白hSav1和Mst1之间的相互作用；应用细胞免疫荧光共定位，进一步证实二者之间的相互作用。在HeLa细胞中，分别单独或同时转染质粒pcDNA／4TO-Flag—Mst1和pCMV—HA—hSav1，转染36h后，加入凋亡诱导剂顺铂（50μmol／L）作用14h。应用磷脂结合蛋白碘化丙啶（Annexin V／PI）法检测细胞凋亡，观察蛋白hSav1高表达对Mst1介导的细胞凋亡的影响。结果载体pCMV-HA—hSav1与pcDNA／4TO—Flag-Mst1构建成功，测序结果表明无突变或缺失。免疫共沉淀结果显示，蛋白hSav1可以在Mst1抗体的免疫沉淀物中检测出来，蛋白Mst1可以在hSav1抗体的免疫沉淀物中检测出来。细胞免疫荧光的结果显示，二者的荧光在细胞内存在共定位，并可充分融合。HeLa细胞中，单独Mst1蛋白高表达组的细胞凋亡率为24．5％±2．4％，单独hSav1蛋白高表达组与对照组比较，无明显细胞凋亡。蛋白Mst1和hSav1高表达组的细胞凋亡率为39．3％±4．0％，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论蛋白hSav1与Mst1在HeLa细胞内存在相互作用，蛋白hSav1高表达可明显促进由蛋白Mst1介导的细胞凋亡。

高表达蛋白hSav1对人胚肾HEK293增殖能力的影响

目的 观察高表达人Salvadorl（hSav1）蛋白对人胚肾293（HEK293）细胞增殖的影响.方法 构建含有绿色荧光蛋白（GFP）的hSav1质粒GFP-N1-hSav1;将构建好的GFP-N1-hSav1质粒在脂质体Lipofectamine 2000的介导下转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察质粒转染效率;分别在转染后12、24、36、48 h通过噻唑蓝（MTT）比色法计算细胞增殖抑制率,抑制率=[（对照-空白）-（给药-空白）]/（对照-空白）×100%;转染后36 h加入5-溴-2＇-脱氧尿苷（BrdU）,通过其掺入比率来显示hSav1对细胞增殖的影响.结果 质粒GFP-N1-hSav1构建成功,转染效率为70%-80%左右,蛋白hSav1明显高表达;MTT结果显示转染质粒后12、24、36、48 h,高表达蛋白hSav1组的细胞增殖抑制率分别为2%、5%、15%、23%,而阴性对照分别为2%、3%、2%、2%;BrdU结果显示,在HEK293细胞中高表达蛋白hSav1后细胞增殖抑制率为（27.3±3.8）%,阴性对照组的细胞增殖抑制率为（12.9±5.3）%,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 在人胚肾HEK293中高表达蛋白hSav1可明显抑制细胞增殖能力.