重组pEGFP—hSnu 114质粒的构建及表达

目的将hSnu114基因定向连人pEGFP质粒GFP的下游，使hSnu114蛋白可与绿色荧光蛋白在真核细胞内融合表达。从而为进一步研究hSnu114蛋白的功能奠定实验基础。方法本实验已经构建tr1E57R／T—hSnu114和pcDNA3．1（-）-hSnu114重组质粒，想要构建pEGFP—hSnu114重组质粒，需通过引入SalⅠ酶切位点，调整N端起始密码子与绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）基因之间的序列，使其不破坏读码框，融合蛋白正确表达。PCR扩增出hSnu114的第一部份（SalⅠ～MunⅠ基因序列），从hSnu114-peDNA3．1（-）重组质粒回收hSnu114的第二部分（MunI～BamHI片段），定向克隆至T／A载体，构建hSnu114全长（SalI～BamHI）pTZ57R／T重组质粒。采用SalI和BamHI双酶切方法，从重组质粒中获得hSnu114全长，将该基因片段连接入pEGFP质粒。将构建成功的pEGFP—hSnu114质粒，转染人HeLa细胞，荧光显微镜下可观察绿色荧光蛋白表达。进行Western印迹检测。结果①hSnu114Sal1～MunI目的片段获取。②将该pEGFP—hSnu114质粒进行双酶切鉴定可见hSnu114全长片段。③转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。④Western印迹可检测到pEGFP—hSnu114融合蛋白：结论①hSnu114全长成功载入pEGFP质粒。②hSnu114蛋白可与绿色荧光蛋白在真核细胞中融合表达。