hSulf-1基因腺病毒表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖、迁移能力的影响

目的构建携带人硫酸酯酶1基因(hSulf-1)的腺病毒载体,研究其对于人脐静脉内皮细胞ECV-304增殖、迁移能力的影响。方法通过基因操作技术将hSulf-1基因插入到腺病毒基因组中,构建重组腺病毒Ad5-hSulf1;应用蛋白质免疫印迹法检测hSulf-1蛋白在ECV-304细胞中的表达及细胞内磷酸化Akt、ERK的表达变化;MTT实验检测hSulf-1过表达对于ECV-304细胞增殖的影响;采用划痕实验研究hSulf-1过表达对于ECV-304细胞迁移的影响。结果成功构建携带目的基因hSulf-1的腺病毒载体;免疫印迹结果表明hSulf1基因过表达会下调ECV-304细胞Akt和ERK信号分子的磷酸化水平;细胞增殖实验结果表明hSulf1基因过表达抑制了ECV-304细胞增殖,感染复数为50、100时细胞存活率下降至(68.49±0.05)%以及(67.78±0.06)%(P<0.05);划痕实验结果表明hSulf1基因过表达能够抑制细胞的迁移,相比于对照组细胞迁移能力减弱(P<0.01)。结论重组腺病毒Ad5-hSulf1介导的hSulf-1基因在ECV-304细胞中的过表达明显抑制细胞增殖及迁移,为hSulf-1用于肿瘤及血管生长相关疾病的基因治疗奠定了基础。

肝癌组织hSulf-1基因表达与其甲基化状态的关系

目的研究肝细胞肝癌组织中人硫酸酯酶-1（hSulf-1）基因甲基化的状态,其mRNA以及蛋白表达情况及与甲基化状态的相关性,探讨hSulf-1基因甲基化在肝癌发生发展中的作用。方法应用RT-PCR、甲基化特异性PCR及免疫印迹法,测定42例肝癌组织及其癌旁正常组织hSulf-1的mRNA、甲基化及蛋白表达水平,并分析hsulf-1基因表达水平及甲基化与肝癌临床特征的关系。结果在肝癌组织中,hSulf-1 mRNA和蛋白表达水平明显低于癌旁正常组织,而正常肝组织几乎检测不到。肝癌组织hSulf-1甲基化率为66.7%（28/42）,而在癌旁正常组织中hSulf-1甲基化率为7.1%（3/42）,二者之间差异有统计学意义（P〈0.05）,在hSulf-1 mRNA表达缺失或下调的31例肝癌组织中,其中有25例发生甲基化（χ2=8.45, P〈0.05）。在肝癌组织中,甲基化组hSulf-1 mRNA及蛋白表达明显低于非甲基化组（分别为0.687±0.092 vs 2.324±0.123,P〈0.01; 0.825±0.119 vs 2.212±0.178, P〈0.01）。hSulf-1基因甲基化与患者肝硬化密切相关。结论肝细胞肝癌hSulf-1基因mRNA及蛋白表达明显下降、其甲基化程度明显增高,且hSulf-1基因的甲基化状态与mRNA及蛋白的表达情况具有某种联系,提示hSulf-1基因的甲基化状态可能与肝癌的发生、发展有关。

Hsulf-1在肝癌细胞系中的作用及STAT3信号通路研究

目的基于肝癌细胞中人硫酸酯酶-1(human sulfatase-1,Hsulf-1)基因对STAT3信号通路的影响,探讨Hsulf-1基因在肝癌发生发展中的作用。方法应用RT-PCR方法测定Hsulf-1在肝癌细胞中的表达;通过Western blot方法测定Huslf-1在HGF加入前后对STAT3磷酸化(p-STAT3)水平及下游蛋白的影响。结果 5-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-d C和曲古抑菌素Actrichostain A,TSA)处理Hep G2细胞中Hsulf-1表达增加,且2者具有协同作用;与正常细胞相比,Hsulf-1在肝癌细胞系中(Hep G2,Hep3B,Huh-7,SMMC-7221)表达水平下降,在转染pc DNA3.1(+)/Hsulf-1以及pc DNA3.1(+)/STAT3siRNA-Hsulf-1中的Hep G2细胞,Hsulf-1的蛋白表达量增加,p-STAT3和c-met的表达水平下降,在未转染组以及转染阴性siRNA的Hep G2细胞中,结论则相反。结论 Hsulf-1在肝癌细胞中表达下降;Hsulf-1在肝癌细胞中可抑制由HGF刺激的p-STAT3及下游蛋白的表达水平。

人芳香基硫酸酯酶(HSulf-1)基因的原核表达及酶活初步研究

人芳香基硫酸酯酶(HSulf-1)是一类分泌型蛋白,能在中性条件下改变硫酸肝素蛋白聚糖(HSPGs)的硫酸化状态,从而影响多种信号分子与其相应受体的结合,进而影响细胞信号通路。鉴于HSulf-1具有重要的潜在应用价值,为获得大量纯化蛋白以探索其功能与应用,文章将HSulf-1功能域基因片段与pGEX-6p-1表达载体连接构建成重组质粒,在原核表达系统BL21中表达、分离纯化了HSulf-1的功能域片段,并以4-Mus为底物用荧光光度法进行了酶活性的测定。结果表明,原核表达能得到电泳纯级的HSulf-1纯化蛋白,但其具有酶活性的条件需要进一步探索。

hSulf-1过表达提高乳腺癌MCF-7细胞对PARP抑制剂AZD2281的敏感性

目的:探讨人硫酸酯酶-1(human sulfatase 1,hSulf-1)基因过表达是否提高乳腺癌MCF-7细胞对PARP抑制剂AZD2281的敏感性。方法:采用不同浓度AZD2281处理细胞,并筛选AZD2281处理的最佳浓度。将携hSulf-1基因的重组腺病毒Ad5-hSulf1感染MCF-7细胞,以Ad-hSulf1和AZD2281单独或联合处理MCF-7细胞,以Ad5-EGFP处理为对照。采用流式细胞术检测细胞周期,克隆形成实验检测细胞克隆形成率,Western blotting检测细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)及磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)的表达,Transwell法、MTT法分别检测细胞的迁移及增殖。结果:AZD2281浓度为7μmol/L时对MCF-7细胞的抑制作用趋于峰值,用于后续实验。Ad5-hSulf1+AZD2281联合处理与AZD2281单独处理相比,MCF-7细胞的G2/M期细胞比例明显增多[(22.15±0.17)%vs(17.44±0.57)%,P<0.01],细胞克隆形成率[(21.43±1.52)%vs(49.43±1.44)%,P<0.01]及细胞周期蛋白CDK4的表达[(0.67±0.02)vs(0.72±0.02),P<0.05]、AKT的磷酸化水平[(0.17±0.003)vs(0.42±0.02),P<0.01]均明显降低,同时细胞的增殖率和迁移能力也有明显下降[(57.69±4.83)%vs(79.35±5.44)%;(10.33±1.53)个vs(50.67±2.31)个,均P<0.01]。结论:hSulf-1过表达可明显提高乳腺癌细胞MCF-7对AZD2281的化疗敏感性,阻滞细胞周期于G2/M期,并更明显地抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,这一效应可能是通过调节细胞周期蛋白CDK4及AKT通路产生的。

Hsulf-1介导PI3K/AKT信号通路抑制肝癌细胞侵袭转移的作用机制研究

目的探讨人硫酸酯酶-1(Hsulf-1)基因介导磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路抑制肝癌细胞侵袭转移的作用机制。方法将构建成功的pcDNA 3.1(+)-Hsulf-1质粒及Hsulf-1 siRNA质粒分别转染肝癌细胞系SMMC7221细胞,应用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理,分为Hsulf-1过表达组、Hsulf-1 siRNA组、抑制剂组及空白组;采用RT-PCR法及Western blot法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)和β连环蛋白(β-catenin)的mRNA及蛋白表达水平,采用Transwell小室实验法检测细胞迁移能力。结果Hsulf-1过表达组E-cadherin和β-catenin mRNA表达水平均明显高于空白组(均P<0.05);Hsulf-1 siRNA组、抑制剂组E-cadherin和β-catenin mRNA表达水平均明显低于空白组(均P<0.05)。与空白组比较,Hsulf-1过表达组Hsulf-1、E-cadherin和β-catenin蛋白表达水平均明显为高,p-AKT均明显为低(均P<0.05);Hsulf-1 siRNA组p-AKT蛋白表达水平明显为高,Hsulf-1、E-cadherin和β-catenin蛋白表达水平均明显为低(均P<0.05);抑制剂组p-AKT、E-cadherin和β-catenin蛋白表达水平均明显为低(均P<0.05)。与Hsulf-1 siRNA组比较,抑制剂组p-AKT、E-cadherin和β-catenin蛋白表达水平均明显为低(均P<0.05)。与空白组比较,Hsulf-1过表达组、Hsulf-1 siRNA组SMMC7221细胞迁移数均明显为高,抑制剂组SMMC7221细胞迁移数明显为低(均P<0.05);与Hsulf-1 siRNA组比较,抑制剂组SMMC7221细胞迁移数明显为低(P<0.05)。结论Hsulf-1基因可通过PI3K/AKT信号通路刺激E-cadherin,β-catenin的表达,抑制肝癌细胞侵袭转移,是肝癌侵袭转移的重要机制。

缺氧环境下HSulf-1,HIF-1α在HaCaT细胞中的表达及HSulf-1过表达载体的构建

目的探讨HSulf-1,HIF-1α在缺氧时人角质形成细胞株HaCaT细胞中的表达并构建HSulf-1基因过表达载体。方法 Western blot法检测不同缺氧浓度下HaCaT细胞中HSulf-1,HIF-1α蛋白的表达;构建重组质粒p CDH-HSulf-1;Western blot法筛选HSulf-1过表达稳转HaCaT细胞株。结果 HSulf-1在缺氧条件下低表达,与HIF-1α表达呈负相关;成功筛选过表达HaCaT稳定细胞株。结论 HSulf-1低表达,与肿瘤细胞或肿瘤组织中表达一致,过表达可抑制肿瘤细胞增殖。推测过表达HSulf-1可能抑制角质形成细胞的增殖,构建HSulf-1基因过表达载体,便于进一步体内外研究与角质形成细胞增殖的影响。