稳转hTERT绵羊睾丸细胞系的建立

羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中,通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术,成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统,建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示,hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快,性状较稳定,表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系,为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。

RNA干扰技术靶向hTERT基因治疗肝癌的实验研究

背景与目的:RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的新基因阻断技术,在基因功能研究、基因治疗方面已显示出巨大的前景。目前,利用RNAi已抑制了包括cyclophilin、GAPDH、p53、c-myc在内的多个内源基因的表达。同时在艾滋病、病毒性肝炎等的治疗研究中也已取得一定进展。但对肝癌等恶性肿瘤中高表达的hTERT基因,国内外还未见相关研究报道。本研究利用RNAi技术,在体内外抑制hTERT基因表达,探讨RNAi对肝癌治疗的可行性。方法:设计干扰hTERT基因的小片段RNA,构建重组表达质粒pTZU6+1-shRNA-hTERT并导入肝癌SMMC7721细胞株和裸鼠移植瘤,在体内外诱导RNAi,采用流式细胞检测技术、RT-PCR法、免疫组化等同时检测RNAi治疗组和对照组hTERT基因表达及细胞增殖变化。结果:体外细胞实验显示,重组质粒pTZU6+1-shRNA-hTERT导入肝癌SMMC7721细胞株3～7天后,肝癌细胞生长抑制率达37.5%;细胞周期相分布发生显著变化,S期细胞明显减少,G1/G0期细胞显著增加;hTERT的mRNA表达由99.4%下调到53.1%,hTERT蛋白表达由86.3%下调到46.6%。裸鼠体内实验结果显示,质粒pTZU6+1-shRNA-hTERT注射裸鼠皮下移植瘤7天后,瘤体积明显缩小,hTERT的mRNA表达由99.1%下调到76.2%,hTERT蛋白表达由87.2%

榄香烯诱导人脑胶质瘤U251细胞凋亡及对端粒酶活性和hTERT表达影响的研究

目的:探讨榄香烯诱导人脑胶质瘤U251细胞凋亡及其影响端粒酶活性及其催化亚单位人端粒酶逆转录酶(hTERT)表达的机制。方法:将榄香烯处理人脑胶质瘤U251细胞株后,用MTT法检测细胞增殖抑制率,并求出半数抑制浓度(IC50),倒置显微镜和电镜观察经榄香烯处理的U251细胞形态,流式细胞仪和原位末端标记技术检测细胞周期及细胞凋亡率的变化,免疫荧光技术观察凋亡小体,流式细胞仪测定bcl-2表达水平,端粒重复扩增(TRAP)法测定端粒酶活性的变化,RT-PCR检测bcl-2和hTERT的表达。结果:榄香烯对U251细胞株增殖具有抑制作用,呈剂量和作用时间的依赖性,IC50为0.062mg/ml,倒置显微镜下可见榄香烯组细胞皱缩、变小,电镜下可见具有典型新月形核的凋亡细胞和凋亡小体,流式细胞仪检测榄香烯阻滞U251细胞周期中S期向G2/M期的转变过程,减少有丝分裂,并引起细胞凋亡,免疫荧光技术观察凋亡小体,TRAP法发现榄香烯可以降低端粒酶活性的变化,呈时间和剂量依赖型。RT-PCR分别证实榄香烯降低bcl-2和hTERT基因表达水平。结论:榄香烯诱导人脑胶质瘤U251细胞凋亡,并抑制U251细胞端粒酶的活性,榄香烯作用于胶质瘤的分子生物学机制可能通过抑制bcl-2表达,下调hTERT基因,降低端粒酶的活性,从而诱导细胞调亡。

CD82、hTERT蛋白的表达及HPV感染与阴茎癌的关系研究

目的:检测CD82、hTERT(人端粒酶逆转录酶)蛋白在阴茎癌组织中的表达情况以及阴茎癌组织中的HPV感染情况,以探讨其与阴茎癌病理分期和分级之间的相互关系以及在腹股沟淋巴结转移中的预测作用。方法:44例阴茎癌患者均接受阴茎部分/全切除和区域淋巴结切除或清扫术。应用免疫组化技术检测阴茎癌中CD82、hTERT蛋白的表达。同时应用PCR技术检测HPV感染情况。结果:CD82、hTERT和HPV DNA在阴茎癌中的阳性率分别为47.7%、38.6%和25.9%。扩增出的HPV DNA均为HPV16型。病理分级和hTERT蛋白的表达与阴茎癌腹股沟淋巴结转移呈正相关(P=0.032,P=0.041);CD82表达与病理分期亦呈正相关(P=0.045);病理分期、CD82表达和HPV-16 DNA阳性率与阴茎癌腹股沟淋巴结转移无相关性(P=0.627,P=0.094和P=0.633)。结论:病理分级和hTERT蛋白表达可能是预测阴茎癌区域淋巴结转移的独立预后因素,可为阴茎癌临床进展的风险及预后的判断提供参考。

c-myc调节人端粒酶逆转录酶(htert)启动子活性的体外研究

目的 :研究c myc对人端粒酶逆转录酶 (htert)启动子的调节作用。方法 :采用Lipofect脂质体转染法将DNA质粒分别转染至肝癌细胞HepG2 、猴肾COS 7细胞和NIH3T3细胞 ,孵育 48h后 ,分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果 :与对照相比 ,载有htert 80 0bp启动子的质粒TERTLuc(80 0 )在肿瘤细胞HepG2 中活性显著增强。外源性转录因子c myc可显著上调htert启动子的表达 ,其激活作用与剂量呈正相关。人工突变c myc结合位点明显降低htert启动子的活性。结论 :c myc可直接激活htert启动子的表达 ,是调节端粒酶活性的重要转录因子。

逆转录病毒介导反义hTERT对肺癌细胞的抑制作用

背景与目的:抑制端粒酶活性可以抑制细胞端粒延长,进而抑制永生细胞的增殖。为了探讨以端粒酶为靶的肺癌基因治疗可能性,本实验观察反义人端粒酶逆转录酶组分(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)cDNA对A549肺癌细胞的端粒酶活性和细胞增殖的抑制作用。方法:RT-PCR扩增hTERTmRNA5'起始端835bp的cDNA,分别正向和反向插入到逆转录病毒表达载体pLXSN质粒中,转染包装细胞PT67后获得重组病毒,病毒感染肺癌A549细胞。Westernblot检测hTERT蛋白表达,TRAP法检测端粒酶活性,倒置显微镜观察细胞形态变化和绘制细胞生长曲线了解细胞增殖情况,流式细胞仪和DNA片段电泳观察凋亡情况。结果:反义hTERT作用肺癌A549细胞后hTERT蛋白表达下降,端粒酶活性被抑制,细胞增殖受到抑制并出现明显的细胞凋亡。结论:反义hTERT对肺癌细胞A549端粒酶活性具有明显的抑制作用,抑制细胞生长,促进细胞凋亡,hTERT有可能成为肺癌基因治疗靶点。

苦参素注射液与顺铂联合对人肝癌细胞SMMC-7721端粒酶活性及wtp53、hTERT mRNA表达的影响

目的:探讨苦参素注射液与顺铂(DDP)联合对人肝癌SMMC-7721细胞端粒酶活性及wtp53、hTERTmRNA表达的影响。方法:采用MTT法测定细胞的增殖抑制率,应用金氏公式分析药物间的相互作用,TRAP-ELISA检测端粒酶活性,半定量RT-PCR法检测wtp53和hTERTmRNA表达。结果:苦参素注射液、DDP单独应用均能抑制SMMC-7721细胞增殖,两药联合具有单纯相加或协同作用,与DDP单药组相比,联合用药组的细胞抑制率明显增加(P<0.01),端粒酶活性显著下降(P<0.01),wtp53mRNA表达明显升高(P<0.01),hTERTmRNA表达明显减少(P<0.01)。结论:苦参素注射液和DDP联合应用具有单纯相加或协同抗肝癌SMMC-7721细胞增殖的作用,其机制可能通过上调wtp53和下调hTERT基因表达,从而有效抑制端粒酶活性。

胸腔积液中hTERT mRNACEA CA19-9检测及其意义

目的:探讨人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、CEA、CA19-9在鉴别诊断良恶性胸腔积液的意义。方法:采用全自动化学发光法检测胸腔积液中CEA、CA19-9含量及RT-PCR检测胸腔积液中hTERT mRNA表达。结果:恶性组中hTERTmRNA、CEA、CA19-9阳性率显著高于良性组(P<0.05)。三者在恶性胸腔积液的敏感性(%)、特异性(%)和诊断符合率(%)分别为:hTERT mRNA:81.8/90.5/86.1,CEA:52.3/92.9/72.1,CA19-9:34.1/90.5/61.6。hTERT mRNA+CEA在恶性胸腔积液中诊断阳性率97.7%。结论:三者均有助于良恶性胸腔积液的鉴别诊断,而hTERT mRNA对于鉴别良恶性胸腔积液有更大的临床价值,CA19-9不宜作为首选指标;hTERT mRNA和CEA联合检测可以进一步提高恶性胸腔积液的阳性检出率,有助于提高其诊断价值。

枸杞多糖对小鼠移植性肝癌端粒酶活性及hTERT蛋白表达的影响

目的探索枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)对小鼠移植性肝癌端粒酶活性及其限速酶hTERT表达的影响。方法采用皮下接种法建立小鼠移植性肝癌模型,将96只小鼠随机分成正常对照组,模型组,LBP高、中、低(20,10,5 mg/kg·d)剂量组和环磷酰胺(20 mg/kg·d)组。观察LBP对小鼠肿瘤体积、抑瘤率的影响。PCR-TRAP-ELISA法检测端粒酶的活性,Western blot测定hTERT蛋白表达。结果 20,10,5 mg/kg·d的LBP能明显减小肿瘤细胞的体积和质量(P<0.05),抑瘤率分别为42.23%、25.10%和9.16%;同时,LBP(20,10mg/kg·d)能明显抑制肝癌组织hTERT蛋白表达(P<0.05),降低端粒酶的活性(P<0.05)。结论 LBP可通过抑制小鼠肝癌组织hTERT蛋白表达、降低端粒酶的活性,从而对小鼠移植性肝癌的生长起到抑制作用。

3种卵巢癌细胞中hTERT转录水平及其与端粒酶活性的相关性研究

背景与目的:端粒酶在约90%的肿瘤细胞中有活性而在绝大多数正常细胞中受抑,催化亚单位端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)是端粒酶的重要组成部分,其表达的调控主要发生在转录水平。端粒酶、hTERT、hTERT启动子三者之间密切相关。本研究探讨卵巢癌细胞系中hTERT启动子的活性及其与hTERTmRNA表达和端粒酶活性之间的关系。方法:应用脂质体转染法将hTERT核心启动子基因转入3种卵巢癌细胞OVCAR3、SKOV3、3AO及正常卵巢上皮细胞中,并用荧光素酶检测实验检测其中hTERT启动子的活性;应用RT-PCR半定量法检测这4种细胞中hTERTmRNA的表达水平;应用PCR-ELISA定量检测这4种细胞中端粒酶的活性。同时以端粒酶阳性的永生化人胚肾成纤维细胞HEK293作为阳性对照,以端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞HELF作为阴性对照。结果:OVCAR3、SKOV3、3AO细胞及正常卵巢上皮细胞中的hTERT启动子活性(视每种细胞中pGL3-control的启动子活性为100%)分别为31.4%、20.3%、17.7%和0.3%;hTERTmRNA的相对表达水平(视SKOV3的表达水平为1.00)分别为1.30、1.00、0.63和0;端粒酶活性分别为0.580、0.414、0.386和0.103(>0.200时定为阳性)。3种卵巢癌细胞中hTERT启动子活性、hTERTmRNA表达水平和端粒酶活性均特异性增高。

hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用

为了研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用,并探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞hTERT基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖状态,应用TRAP-ELISA、TRAP-PAGE方法检测HL-60细胞端粒酶活性。结果发现反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,hTERT基因表达明显受抑,细胞生长受抑,增殖能力减弱,其抑制作用具有序列特异性及浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示反义寡核苷酸10、20和30μmol/L作用组OD450-690值分别为1.504±0.47、1.223±0.39,0.944±0.16,与未作用组(2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);正义寡核苷酸20μmol/L作用组(OD450-690值为2.376±0·65)与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。TRAP-PAGE检测表明hTERTASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol/L作用组条带最少。结论hTERT基因反义寡核苷酸能够通过封闭hTERT基因的表达而抑制HL-60细胞增殖,下调端粒酶活性。

hTERT启动子调控osm基因表达在体外的抑癌作用

背景与目的:肿瘤基因治疗中基因特异表达具有重要意义,构建特异表达载体是肿瘤基因治疗的基础。本研究探讨端粒酶催化亚基(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)启动子调控抑瘤素(oncostatinM,osm)基因在端粒酶阳性肿瘤细胞中表达的特异性,以及osm对肿瘤细胞增殖的影响。方法:构建phTERT-osm表达载体,瞬时转染肿瘤细胞;采用RT-PCR法检测外源基因表达,用MTT法检测osm基因表达对肿瘤细胞生长的影响。结果:hTERT启动子调控osm基因在端粒酶阳性HepG2细胞中明显表达,而在正常人胚肺成纤维细胞(humanembryoniclungfibroblast,HEL)中未见表达。osm的表达对端粒酶阳性HepG2、HeLa、Glc和A549细胞的增殖有明显的抑制作用,抑制率为12.4%～46.0%;而对端粒酶阴性的HEL细胞没有明显的影响。结论:hTERT启动子在端粒酶阳性肿瘤细胞中能明显激活phTERT-osm载体表达osm,并抑制肿瘤细胞的生长。

hTERT转染神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA检测

目的以逆转录病毒PLXSN为载体,将hTERT基因转染入体外培养的人神经干细胞,检测神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA表达情况,为建立永生化神经干细胞系提供一种新的思路。方法体外扩增人神经干细胞及基因转染后,应用PCR-ELISA法检测神经干细胞端粒酶活性,荧光定量PCR法检测hTERT mRNA表达情况。结果通过逆转录病毒介导的hTERT基因转染人神经干细胞后,端粒酶活性明显升高,持续表达,hTERT mRNA也早期呈高水平表达,但继之下降,维持在一个较低水平。结论转染hTERT基因后的神经干细胞具有表达高水平端粒酶活性,并稳定表达,这为建立基因工程的永生化神经干细胞系奠定了基础。而hTERT mRNA则逐渐下降,并维持在一个较低水平,不能作为检测神经干细胞增殖和分化能力的指标。

食管癌和淋巴结转移组织中c-myc,hTERT和c-MET蛋白的表达

目的:探讨食管癌和淋巴结转移组织中c-myc、hTERT和c-MET的表达。方法:利用组织微阵列技术,采用免疫组化ABC法,测定58例食管癌及其相应的癌旁组织、8例转移淋巴结组织中c-myc、hTERT和c-MET的表达。结果:癌旁、癌及淋巴结转移组织中c-myc阳性率分别为7%,66%,75%;hTERT阳性率分别为0%,48%,75%;c-MET阳性率分别为7%,34%,75%;癌旁和癌组织间c-myc和hTERT的表达差异有统计学意义(P<0.05),癌旁和癌组织间,以及癌和淋巴结转移灶之间c-MET的表达差异均有统计学意义(P<0.05)。食管癌组织中c-myc与hTERT的表达呈正相关(r=0.411,P=0.002),c-myc与c-MET的表达不相关(r=0.211,P=0.146)。结论:c-myc、hTERT和c-MET的高表达可能与食管癌发生发展相关,c-myc可能参与了hTERT的激活过程,c-MET的高表达可能参与了食管癌淋巴结的转移过程。

吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞凋亡及端粒酶催化亚基(hTERT)表达的影响

目的:探讨左金丸的主要成分吴茱萸碱和小檗碱对结肠癌HT29细胞凋亡及端粒酶催化亚基(hTERT)表达的影响,为临床应用左金丸治疗大肠癌提供实验依据。方法:体外培养人结肠癌HT29细胞,加入不同浓度的吴茱萸碱及盐酸小檗碱进行培养,采用活细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖,Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡变化,RT-PCR法检测hTERT的表达。结果:吴茱萸碱和盐酸小檗碱作用HT29细胞后,增殖明显受到抑制,呈剂量和时间依赖性;流式细胞仪检测表明吴茱萸碱和盐酸小檗碱能够诱导细胞凋亡,呈剂量依赖性;并且端粒酶hTERT表达降低,具有剂量依赖关系。结论:吴茱萸碱和盐酸小檗碱对结肠癌HT29细胞具有显著生长抑制作用,该抑制作用可能通过下调端粒酶hTERT基因表达,降低端粒酶的活性,从而诱导细胞凋亡。

三氧化二砷诱导Raji细胞凋亡过程中端粒酶活性和hTERT、bcl-2基因表达的研究

目的:研究三氧化二砷(As2O3)诱导Raji细胞凋亡并初步探讨端粒酶活性、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因及bcl-2基因表达之间的关系。方法:通过姬姆萨染色来观察细胞的凋亡;以RT-PCR分析bcl-2、hTERT基因的mRNA表达水平;利用半定量多聚酶链反应-酶联免疫反应(PCR-ELISA)方法检测As2O3处理Raji细胞前后端粒酶活性的改变。结果:2μmol/LAs2O3能诱导Raji细胞凋亡,2μmol/LAs2O3作用于Raji细胞8h、12h、24hhTERTmRNA相对表达量分别与对照组比较有显著差异(P<0.05),12h、24hbcl-2mRNA相对表达量分别与对照组比较有显著差异。2μmol/LAs2O3作用48h后,Raji细胞中端粒酶活性即出现下降,作用72h、96h,端粒酶的活性明显受到抑制,吸光度分别为0.829、0.328、0.291,分别与空白对照组比较有显著差异(P<0.05)。结论:As2O3诱导Raji细胞凋亡过程中,端粒酶活性下调与hTERT、bcl-2基因mRNA表达下降有关。

RNAi沉默hTERT基因诱导大肠癌SW480细胞凋亡

目的:探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的表达对大肠癌细胞SW480凋亡的影响。方法:构建携带hTERT小发夹干扰RNA(small hairpin RNA,shRNA)的重组表达载体pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA(简称hTERT-shRNA质粒),脂质体法转染SW480细胞,RT-PCR法检测不同转染时间点SW480细胞中hTERTmRNA的表达。TRAP-PCR-ELISA法检测转染后48h SW480细胞的端粒酶活性,透射电镜观察转染后48h SW480细胞超微结构。结果:hTERT-shRNA质粒转染48h时,hTERT-shRNA组SW480细胞hTERT mRNA表达的抑制率显著高于空白组、脂质体组、NC-shRNA组(75.0%vs39.2%、33.3%、28.0%,P<0.05)。hTERT-shRNA转染组SW480细胞端粒酶活性显著低于空白组、脂质体组、NC-shRNA组(2.242±0.285vs2.756±0.089、2.693±0.225、2.691±0.120,P<0.05)。hTERT-shRNA质粒转染后的SW480细胞体积明显缩小、细胞核固缩、染色质不均匀地沿核膜下聚集、空泡形成增多,出现典型的凋亡形态。结论:RNAi可有效沉默SW480细胞中hTERT的表达,降低SW480细胞端粒酶活性,诱导SW480细胞凋亡。

Bmi-1、hTERT在乳腺癌细胞中的表达及与凋亡的关系

目的研究原癌基因Bmi-1和hTERT的表达变化及其与细胞凋亡的关系,探讨它们在乳腺癌发生、发展过程中的作用。方法采用MTT法检测乳腺癌细胞的增殖抑制情况,并确定所选用的药物浓度。RT-PCR、Western Blot检测Bmi-1、hTERT的mRNA及蛋白的表达情况;TUNEL、流式细胞技术检测乳腺癌细胞的凋亡情况。结果 5-FU对乳腺癌细胞有明显抑制作用,各实验组与对照组OD值的差异有统计学意义(P<0.05)。用5-FU干预后,实验组Bmi-1和hTERT的mRNA及蛋白表达水平均降低,细胞凋亡指数增加,与对照组相比差异显著有统计学意义(P<0.05),经统计学分析两者呈正相关(P<0.05),且两者的表达与凋亡呈负相关(P<0.05)。结论 Bmi-1和hTERT的表达下调可促进乳腺癌细胞凋亡。

hTERT基因核心启动子调控的TRAIL基因表达载体的构建及对卵巢癌细胞凋亡的影响

目的:构建了人端粒酶逆转录酶(humantelomeraseresersetranscription,hTERT)基因核心启动子调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL)基因真核表达载体并观察其对卵巢癌细胞凋亡的诱导作用。方法:从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增了TRAIL基因片段。测序正确后,利用基因重组方法将TRAIL基因克隆入带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中。获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTER-Tpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL。用脂质体转染法,将其转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞中,应用RT-PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达情况,以流式细胞术检测TRAIL对卵巢癌细胞的细胞周期的影响及诱导凋亡的作用。结果:经酶切鉴定及测序结果证实,所构建的重组载体正确。转染hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL载体后,SKOV3细胞的增殖受到抑制,出现明显凋亡。结论:hTERT基因核心启动子在卵巢癌细胞中可特异性地调控其下游TRAIL基因的表达,并发挥其促凋亡作用。构建由hTERT基因核心启动子调控的表达载体,可能是一种新型和有希望的肿瘤治疗的途径。

人乳头状瘤病毒感染及端粒酶hTERT表达与宫颈癌关系的研究进展

人乳头状瘤病毒(HPV)感染和人子宫颈癌的发生密切相关,HPV致癌作用的主要基因为E6、E7。E6蛋白能诱导端粒酶的表达,其机制是激活了端粒酶催化亚基hTERT的转录活性。端粒酶激活是HPV感染后导致宫颈上皮瘤变和宫颈癌发生的关键性步骤。现就HPV感染及端粒酶hTERT在宫颈癌形成中的协同作用进行综述。