胃癌及癌前病变中hTERT基因和c-myc蛋白的表达意义

目的:探讨胃癌及癌前病变中端粒酶逆转录酶(hTERT)基因和c-myc蛋白的表达及相互关系。 方法:以41例胃癌和25例相应非癌组织为研究对象,采用免疫组化和原位杂交方法检测c-myc蛋白、hTERT蛋白和hTERTmRNA,并对各指标阳性表达率和相关性进行比较分析。 结果:正常胃黏膜-肠型化生-异型增生-胃癌中,c-myc蛋白的阳性率分别为0,30％,53％,59％;hTERTmRNA的阳性率为10％,39％,67％,85％;hTERT蛋白为0,30％,60％,78％。三者在异型增生、胃癌中分别与正常组相比差异有显著性,而且肠化与胃癌组比较也分别具有显著性(P<0.05)。胃癌中,c-myc和hTERT蛋白的表达在低未分化、进展期、有淋巴结转移和浸润至浆膜层的肿瘤中显著增高(P<0.01～0.05)。而hTERTmRNA的表达仅与肿瘤分期有关。肠化、异型增生和胃癌三组中,c-myc和hTERTmRNA及hTERTmRNA和蛋白间分别具有显著性正相关(r_s=0.504～0.696,P<0.05)。 结论:c-myc和hTERT的过表达是胃癌发生中的早期事件,其表达水平随着胃癌恶性程度的增加而增加;c-myc在转录水平上激活hTERT的表达,可能是胃癌发生发展的重要阶段。

hTERT基因核心启动子调控的TRAIL基因表达载体的构建及对卵巢癌细胞凋亡的影响

目的:构建了人端粒酶逆转录酶(humantelomeraseresersetranscription,hTERT)基因核心启动子调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL)基因真核表达载体并观察其对卵巢癌细胞凋亡的诱导作用。方法:从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增了TRAIL基因片段。测序正确后,利用基因重组方法将TRAIL基因克隆入带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中。获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTER-Tpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL。用脂质体转染法,将其转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞中,应用RT-PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达情况,以流式细胞术检测TRAIL对卵巢癌细胞的细胞周期的影响及诱导凋亡的作用。结果:经酶切鉴定及测序结果证实,所构建的重组载体正确。转染hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL载体后,SKOV3细胞的增殖受到抑制,出现明显凋亡。结论:hTERT基因核心启动子在卵巢癌细胞中可特异性地调控其下游TRAIL基因的表达,并发挥其促凋亡作用。构建由hTERT基因核心启动子调控的表达载体,可能是一种新型和有希望的肿瘤治疗的途径。

慢病毒介导hTERT基因对肝细胞生物学特性的影响

目的：研究慢病毒介导人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因对人肝细胞L02生物学特性的影响。方法：将表达hTERT基因的重组慢病毒感染人肝细胞L02，通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆。分别采用实时荧光RT-PCR和PCR—ELISA方法检测转染前后L02肝细胞的hTERT-mRNA水平和端粒酶活性的变化。通过MTT法、流式细胞术（FCM）及RT-PCR等方法观察其形态和生物学功能的变化。结果：转染后的L02肝细胞存在hTERT基因过表达和端粒酶活性上调，体外培养条件下维持肝细胞原有形态，存活期显著延长，增殖能力较强，同样具有表达和分泌ALB及糖原合成的功能。结论：外源性hTERT基因的异位表达不仅上调L02肝细胞的端粒酶活性，而且促进其增殖而不影响基本功能。

人端粒酶催化亚基hTERT基因启动子的克隆

为了确定人端粒酶催化亚基 h TERT基因的启动子结构特征 ,采用 Panhandle PCR技术 ,从正常人外周血单核细胞基因组 DNA中扩增 h TERT基因 5′端上游旁侧序列 ,结果获得了 h TERT基因翻译起始位点上游 2 0 90 bp的基因组 DNA序列。序列分析表明 h TERT基因的启动子区域缺少典型真核启动子的核心元件 ( TATA box和 CAAT box) ,但含有多个已知转录因子蛋白结合的核心序列 ,如 E box及 Sp1核心序列。提示 h TERT基因的表达可能受特殊的转录因子调控 ,这些转录因子的激活可能与癌变细胞中 h

hTERT基因反义核酸对K562细胞端粒酶活性的影响

目的：探讨人类端粒酶逆转录酶（humantelomerasereversetranscriptase,hTERT）基因的反义寡核苷酸（antisenseoligodeoxynucleotide，ASODN）对K562细胞端粒酶活性的影响。方法：采用多聚酶链反应-酶联免疫测定（PCR－ELISA）方法检测人工合成的反义脱氧寡核苷酸处理K562细胞前后端粒酶活性的改变，以逆转录PCR（RT－PCR）分析hTERT基因mRNA表达水平。结果：hTERT基因的ASODN作用于K562细胞后，hTERTmRNA表达水平显著下调，其端粒酶活性明显受到抑制。结论：hTERT基因的ASODN可以在翻译水平显著抑制K562细胞的端粒酶活性，hTERT基因与端粒酶的活性密切相关。

小干扰RNA抑制鼻咽癌细胞hTERT基因表达的实验研究

目的 观察鼻咽癌细胞中的RNA干扰效应，确定hTERT基因RNA干扰的有效作用位点，探讨RNA干扰在鼻咽癌基因治疗中的应用前景。方法 利用体外合成法合成针对hTERT基因的小干扰RNA（siRNA）序列，脂质体转染鼻咽癌CNE-2细胞，逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase polymemse chain reaction，RT-PCR）检测转染细胞中hTERT基因的mRNA水平，Western Blot观察siRNA干扰后hTERT蛋白表达水平，噻唑蓝法检测siRNA对细胞生长抑制作用，流式细胞学检测siRNA诱导细胞凋亡的作用。结果 在siRNA转染CNE-2细胞后，hTERT的mRNA表达水平分别下调10％～70％，蛋白表达水平不同程度降低，细胞周期在G0～G1期受阻，并不同程度诱导细胞凋亡。结论 siRNA可在鼻咽癌中有效发挥RNA干扰效应，下调hTERT基因mRNA及蛋白表达水平，降低端粒酶活性，抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡，为鼻咽癌基因治疗研究奠定了一定的基础。

特异性siRNA抑制hTERT基因表达的位置及时间效应

为了探讨不同位点siRNA在不同时间点对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中hTERT mRNA表达的抑制作用,设计并化学合成4对针对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的特异性siRNA。以脂质体法转染入MCF-7细胞,在转染后12h、24h、48h、72h和5d,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中hTERT mRNA的表达。与对照组相比,4段siRNA中有3段在转染后12h即对hTERT mRNA的表达产生抑制,48h抑制率最高,72h后下降,其中位于hTERT mRNA二级结构中的结构相对简单区域的siRNA抑制率最高,达到75%,说明特异性siRNA对hTERT基因有明显的抑制效果,且该抑制效应具有位置及时间依赖性。

hTERT基因表达在肝细胞肝癌发生发展中的作用及意义

目的 研究端粒酶催化亚单位 (h TERT)基因表达在肝细胞肝癌 (HCC)发生发展中的作用及意义。方法 应用免疫组化 (SP法 )和半定量逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)同步检测 6 2例 HCC及其对应癌旁组织、8例正常肝组织中 h TERT及 h TERTm RNA的表达情况 ,分析 h TERT基因表达与 HCC临床病理参数的关系。结果 h TERT蛋白主要定位于肝癌细胞胞浆内 ,偶见核内染色。h TERT和 h TERTm RNA在 HCC中的阳性率分别为 88.71%、82 .2 6 % ,分别明显高于癌旁肝组织的阳性率 9.6 8%、6 .4 5 % ,差异具有非常显著性 (P <0 .0 1)。 h TERT及其 m RNA在 8例正常肝组织均未见表达。统计学分析显示 ,HCC中的 h TERT基因表达与肿瘤分期分级、门静脉有无癌栓、血清中甲胎蛋白表达水平、是否合并 HBV感染等有关 (P <0 .0 5 )。结论 h TERT基因可能在 HCC的发生发展中起着重要作用 ,其表达有望成为 HCC的重要分子生物学指标。

宫颈病变中hTERT基因扩增与高危型HPV感染的关系

目的探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因扩增和高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染在宫颈病变中的关系。方法获取34例正常人,31例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级,33例CINⅡ级,34例CINⅢ级,20例宫颈癌患者的宫颈脱落细胞标本,应用聚合酶链反应(PCR)-反向杂交芯片法检测HPV DNA阳性情况,应用荧光原位杂交技术(FISH)检测hTERT基因扩增情况。结果共检出20种HR-HPV:HPV16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,67,68,69,73,82。CINⅡ级(72.73%)、CINⅢ级(85.29%)、宫颈癌组(90.00%)的HR-HPV DNA阳性比例高于对照组(20.59%),对照组与CINⅠ级(54.84%)组比较差异无统计学意义。宫颈癌组(80.00%)hTERT基因扩增的阳性率高于对照组(0)、CINⅠ级(3.22%)、CINⅡ级(18.18%),宫颈癌与CINⅢ级组(41.18%)比较差异无统计学意义。hTERT基因扩增与HR-HPV感染呈正相关(r=0.238,P<0.05)。结论宫颈病变中hTERT基因扩增与HR-HPV感染呈正相关,HR-HPV感染可能是hTERT基因异常扩增的早期事件,hTERT基因检测可能作为宫颈癌前病变监测的辅助指标,应用于临床早期宫颈病变的诊断中。

正、反义hTERT基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建正、反义hTERT基因真核表达载体,为进一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗作准备。方法根据已发表在Genebank的hTERT cDNA序列,设计并合成了1对两端带特定限制性酶切位点引物,提取子宫颈癌HeLa细胞株总RNA,进行RT-PCR,并将扩增产物TA首先克隆至pGEMR-T载体,然后双酶切pGEM-T载体回收目的片段再克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(±)中,并对重组体进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实构建的正、反义hTERT基因真核表达载体克隆成功,插入片段测序结果与Genebank的hTERT cDNA的部分序列完全一致。结论成功地构建了正、反义hTERT基因真核表达载体,为下一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗打下了实验基础。

急性白血病患儿hTERT基因的表达

目的 探讨人类端粒酶逆转录酶 ( h TERT)基因表达与儿童急性白血病 ( AL)的关系和临床意义。方法 采用逆转录 -聚合酶链反应 ( RT- PCR)方法检测 K5 62白血病细胞株、40例急性白血病患儿和 10例正常对照的 h TERT基因表达。结果 K5 62白血病细胞株、3 0例急性淋巴细胞白血病 ( AL L)患者中 2 3例、10例急性髓系细胞白血病 ( AML)患者中 7例有 h TERT基因表达。h TERT基因表达见于 AL 所有亚型 ,其相对表达水平与 AL 的完全缓解 ( CR)率有相关性 ,相对表达水平≥ 1.0的患儿 CR率低及生存期短。结论 h TERT基因表达与儿童急性白血病发生有关 ,h TERT基因高表达的患者 CR率低、无病生存期短 ,h

三氧化二砷对HL-60细胞hTERT基因表达和端粒酶活性的影响

目的 探讨三氧化二砷 (As2 O3)处理HL 60细胞前后人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因表达和端粒酶活性的改变。方法 采用姬姆萨染色及碘化丙锭染色置流式细胞仪检测来观察细胞的凋亡 ;以RT PCR分析hTERT基因的mRNA表达水平 ;应用间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白含量 ;利用多聚酶链反应 酶联免疫反应 (PCR ELISA)方法检测As2 O3处理HL 60前后端粒酶活性的改变。结果 2 μmol/LAs2 O3诱导HL 60细胞凋亡的过程中 ,hTERTmRNA表达水平显著下调 ,细胞内hTERT蛋白含量也相应降低 ,其端粒酶活性明显受到抑制。结论 As2 O3可通过下调hTERT基因的表达而抑制HL

柔红霉素对转染hTERT基因的人晶状体上皮细胞增殖的影响

目的 研究柔红霉素(DNR)对外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因转染的人晶状体上皮细胞(HLECs)生长的抑制作用及有效药物质量浓度。方法 采用脂质体转染技术,将编码hTERT基因的真核细胞表达质粒pCI-neo-hTERT的质粒ONA导入培养的HLECs,用G418筛选转染成功的抗性克隆并扩大培养,用细胞计数法分别比较转染前后的细胞生长曲线和群体倍增水平(PDL);用MTT比色法检测柔红霉素对转染后HLECs增殖的抑制作用。结果 获得一个可传代达32个群体倍增水平的HLECs克隆,转染后HLECs的生长率高于原代细胞,DNR质量浓度为0.4μg/ml作用1h和0.1μg/ml作用24h能明显抑制转染后的HLECs的增殖(P<0.01),1h和24h的50％抑制质量浓度(ID_(50))分别为2.4μg/ml和0.35μg/ml。结论 外源性hTERT基因的表达可以提高细胞的增殖能力,DNR能有效抑制转染后HLECs的生长。

hTERT基因修饰神经干细胞移植修复大鼠脊髓损伤

目的对神经干细胞的生物学特性进行观察,探讨h TERT基因修饰神经干细胞移植对修复大鼠脊髓损伤的影响。方法体外培养的大鼠神经干细胞,用病毒PLXSN为载体介导h TERT基因反转录转染神经干细胞,分为阴性转染组、对照组与h TERT转染组3个组。经Western blot法检测分析h TERT蛋白的表达。运用细胞生长曲线、CCK-8比色法两种方法,分析细胞生长的优化作用。将造模成功的72只大鼠随机分为h TERT-NSCs、NSCs与对照组3组,每组各分24只,通过改良的Allen打击法来建立大鼠急性脊髓损伤模型。通过斜板试验,BBB评分给各组大鼠进行运动功能检测。通过HE染色及荧光显微镜研究,PKH-26标记的分布情况及NSC存活取材进行病理切片。术后72h通过RT-PCR分析脊髓损伤区周围MMP9/2、AQP/9基因的表达,运用UNEL法分析细胞凋亡情况。荧光显微镜观察PKH-26标记的分布情况及NSCs存活。结果 h TERT基因转染大鼠神经干细胞后,h TERT基因转染组蛋白水平有高表达、细胞的生长速度出现明显增快,相比与阴性h TERT转染组与对照组,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。对照组的细胞凋亡指数略低于阴性转染组,阴性转染组略低于h TERT转染组大鼠下肢运动功能评价。与对照组相比h TERT转染组AQP4/9基因表达均较显著降低。PKH-26标记的阳性细胞数:对照组最少,h TERT转染组最多,阴性h TERT转染组次之,各组差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过PLXSN病毒为载体介导h TERT基因逆转染神经干细胞,可以促进大鼠神经干细胞增殖。h TERT基因修饰神经干细胞移植可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生,降低脊髓损伤区周围AQP/9、神经细胞凋亡和MMP9/2基因的表达,且能够促进大鼠的电生理及肢体运动功能的恢复。

白花蛇舌草对人宫颈癌Hela细胞端粒酶活性及hTERT基因表达的影响

目的探讨白花蛇舌草(HD)对人宫颈癌Hela细胞端粒酶活性和hTERT基因表达的影响,分析HD抗肿瘤机制。方法分别以不同浓度的HD作用于体外培养的Hela细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,用PCR-TRAP-ELISA方法定量检测HD处理后Hela细胞端粒酶活性,用RT-PCR法测定hTERT mRNA的表达水平。结果一定浓度的HD作用于Hela细胞一定时间后可诱导Hela细胞凋亡,端粒酶活性明显降低,hTERT mRNA的表达水平下降。结论HD可能通过下调hTERT基因表达来降低端粒酶活性,进而诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。

siRNA靶向沉默hTERT基因对宫颈癌Caski细胞特性的影响

目的研究siRNA靶向沉默h TERT基因后对宫颈癌Caski细胞特性的影响。方法设计、合成特异性针对h TERT mRNA的siRNA,将其克隆入p Genesil-1.1质粒中,重组成h TERT mRNA-siRNA的表达载体,导致目的基因沉默,是由电转染入宫颈癌Caski细胞,从而产生RNA干扰作用。应用Western印迹法及RT-PCR法检测沉默h TERT基因后对于宫颈癌Caski细胞的蛋白及mRNA的表达情况;检测细胞周期运用流式细胞仪;沉默h TERT基因后宫颈癌Caski细胞的增殖能力可通过CCK-8增殖实验检测。沉默h TERT基因后宫颈癌Caski细胞的侵袭能力可通过小室侵袭实验检测。结果 h TERT基因沉默48 h以后,与空白组及未转染组相比,转染组宫颈癌Caski细胞的蛋白及mRNA表达出现明显降低(P<0.05);细胞周期的检测结果显示S期的细胞数目明显减低,转染组的宫颈癌Caski细胞停留于G0/G1周期,空白组、转染组及未转染组相比差异显著(P<0.05);宫颈癌Caski细胞在转染组的增殖过程中被明显抑制(P<0.05);转染组穿过滤膜的细胞数量明显减少(P<0.05)。结论 Si RNA靶向沉默h TERT基因电转染后,使宫颈癌Caski细胞的增殖和迁移能力得到抑制,一定程度上改善了宫颈癌患者的预后。

hTERT基因沉默对乳腺癌细胞生物学特性及COX-2表达的影响

目的本研究探讨hTERT基因沉默后对乳腺癌细胞生物学特性及环氧化酶-2(COX-2)的影响。方法设计合成特异性针对hTERT mRNA的siRNA,电转染入乳腺癌细胞,以致目的基因沉默。应用RT-PCR及Western blot法检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白的表达状况;应用流式细胞仪检测细胞周期;并通过CCK-8增殖实验检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力;经小室侵袭实验检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力。利用免疫组织化学法检测COX-2蛋白的表达。结果 hTERT基因沉默48h后,hTERT转染组在沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白表达呈现明显降低(P<0.05);细胞周期检测结果示乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞停滞在G0/G1周期,S期的细胞数目减低,三组比较统计学差异明显(P<0.05);CCK-8增殖实验结果表明乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞在hTERT转染组的增殖得到显著抑制(P<0.05);小室侵袭实验结果表明,hTERT转染组穿过滤膜的细胞数量明显减少(P<0.05);免疫组织化学法检测结果显示,COX-2蛋白在hTERT转染组的表达明显降低,并与hTERT基因的表达相关联。结论 hTERT基因沉默后对乳腺癌细胞的增值和迁移能力均有影响,并能降低COX-2蛋白的表达,从而改善乳腺癌患者预后。

端粒酶hTERT基因siRNA表达质粒的构建和鉴定

目的:构建含人端粒酶逆转录酶(Humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)基因不同位点的一系列siRNA真核表达质粒mU6-hTERT1～5,为以端粒酶为靶点的基因治疗鼻咽癌研究奠定基础。方法:将人工合成的针对hTERT基因4个不同位点和1个混乱序列的正反链DNA序列经基因重组定向克隆插入到真核表达质粒载体mU6中,通过PCR检测确定重组结果。根据260nm处紫外红吸收值计算重组质粒的浓度。结果:各对DNA序列均按正确方向插入pmU6质粒,纯度和浓度均符合实验要求。结论:成功构建成了含人端粒酶hTERT基因4个不同位点的siRNA真核表达质粒。

长期培养的CIK细胞hTERT基因表达水平的动态变化

目的:初步探讨长期培养的CIK细胞hTERT基因表达水平的变化,进一步评价CIK细胞治疗的安全性。方法:抽取3名健康人外周静脉血进行CIK细胞培养,每周台盼蓝染色计数细胞,实时荧光定量PCR法检测培养第0、2、7、21及42天的CIK细胞hTERT基因的表达水平,流式细胞仪分析培养第0、7、14、28、49及56天的CIK细胞周期的改变并检测凋亡,MTT法测定培养第14、30天的CIK细胞对肺癌LTE细胞系的细胞毒活性。结果:CIK细胞在体外培养第28天至第35天细胞增殖达高峰,与第0天相比扩增约6.7至15.95倍,此后存活细胞逐渐减少,最终约60天左右细胞全部死亡,与流式细胞仪检测细胞凋亡结果一致。hTERT表达水平在培养48小时最高,较第0天增加约(2.84±1.27)倍,随后随培养时间延长表达水平下降,在培养1周时降至培养初始水平,并在此后的培养过程中维持低水平表达。在CIK培养1周时处于S期细胞比例最高,约(41.27±4.57)%,随培养时间延长G0/G1期细胞比例占绝大部分,在培养第49天G0/G1期细胞比例在90%以上[(97.56±1.17)%];CIK细胞在第14天杀瘤活性约(58.58±8.52)%,在30天时杀瘤活性明显下降,约(32.47±7.51)%。结论:长期培养的CIK细胞随培养时间延长hTERT表达水平下降,未见细胞永生化倾向。

全反式维甲酸对HL-60细胞hTERT基因表达和端粒酶活性的影响

目的 :探讨全反式维甲酸 (ATRA)诱导HL - 6 0细胞分化过程中人类端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白表达和端粒酶活性的改变。方法 :应用间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白含量的变化 ;采用多聚酶链反应 -酶联免疫反应 (PCR -ELISA)方法检测ATRA处理HL- 6 0细胞前后端粒酶活性的改变 ,用碘化丙锭染色经流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果 :ATRA作用于HL - 6 0细胞后 ,细胞内hTERT蛋白含量逐渐降低 ,细胞的端粒酶活性相应受到抑制。结论 :在HL - 6 0细胞分化过程中 ,可以通过hTERT基因的表达下调而抑制端粒酶的活性。