c-fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理大鼠心肌细胞保护作用的实验研究

目的 探讨c fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞的保护作用。方法 烧伤血清采自 3 0 %TBSAⅢ度烫伤Wistar大鼠 ;采用含 1%O2 的混合气体作为缺氧模型 ;采用基因重组技术构建c fos反义基因重组体 ;由Li pofectaminekit介导心肌细胞转染 ;于缺氧复合烧伤血清处理 1,3 ,7h不同时相点采用RT PCR检测c fosmRNA的表达变化 ,采用Westernblot检测c fos蛋白 ,肌钙蛋白 T(TnT)和 β 微管蛋白 ( β Tubulin)的表达变化。 结果 加入烧伤血清并造成缺氧的非转染心肌细胞 (下文称非转染组 ) ,c fosmRNA和蛋白显著表达 ,3h达到最高峰 ,与正常对照组比较 ,TnT和 β Tu bulin表达显著下降 ,7h降至最低水平 ;转染c fos反义基因重组体 (下文称转染组 )后 ,c fosmRNA和蛋白表达显著下降 ,TnT和 β Tubulin表达却显著回升。 结论 缺氧复合烧伤血清处理产生的c fos会引起心肌细胞损伤 ,c fos反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞具有保护作用。

BTEB2反义基因转染对大鼠颈动脉球囊损伤后内皮修复的影响

目的构建反义基本转录元件结合蛋白2(BTEB2)重组腺病毒载体,并研究BTEB2反义RNA对动脉损伤后内皮修复的影响。方法通过RTPCR从培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)中制备BTEB2cDNA,将其反向克隆至腺病毒载体,构建反义BTEB2重组腺病毒;用重组腺病毒局部转染球囊损伤的大鼠颈动脉,观察反义BTEB2基因转染对BTEB2蛋白表达及损伤内皮修复的影响。结果构建的BTEB2反义重组腺病毒经鉴定正确,其滴度为5×1010pfumL;反义BTEB2重组腺病毒转染可显著抑制BTEB2蛋白表达,明显促进内皮的修复,改善损伤动脉的内皮依赖性舒张功能。结论成功构建了反义BTEB2重组腺病毒载体。BTEB2反义基因转染可显著促进大鼠颈动脉球囊损伤后的内皮修复。

c-jun反义基因转染与缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞凋亡关系的研究

目的 探讨c jun反义基因转染与缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞凋亡的关系。方法 烧伤血清采自 3 0 %TBSAⅢ度烫伤Wistar大鼠 ;采用含 1%O2 的混和气体造成缺氧模型 ;采用基因重组技术构建c jun反义基因重组体 ;用Li pofectaminekit介导心肌细胞转染 ;用核苷酸末端转移酶介导的dUTP末端标记法 (TUNEL)检测心肌细胞的凋亡情况 ,同时对凋亡心肌细胞进行计数并作统计学分析。结果 加入烧伤血清并造成缺氧 (下文称非转染组 )后 12h ,2 4h和 48h ,凋亡心肌细胞数 (每高倍视野均数 )分别为 ( 7 1± 0 842 ) ,( 2 8 4± 1 63 5 )和 ( 13 2± 1 5 2 5 ) ;转染c jun反义基因 (下文称转染组 )后 12h ,2 4h和 48h ,凋亡心肌细胞数分别为 ( 4 1± 0 716) ,( 12 3± 1 45 5 )和 ( 8 5± 1 3 41) ,两组比较差异有显著性 (P <0 0 1)。结论 c jun反义基因转染可以减轻缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞凋亡性损伤。

CⅡTA反义基因体外转染对HLA-Ⅱ类抗原表达的抑制作用的研究

目的:针对同种异体细胞移植的免疫反应主要由HLA-Ⅱ类抗原介导,而CⅡTA基因对HLA-Ⅱ分子的表达起严格且专一性的调控作用,拟通过CⅡTA的反义cDNA抑制细胞表面HLAⅡ分子的表达。方法:以RT-PCR从HLAⅡ抗原组成型表达的Raji细胞株克隆CⅡTA反义片段(arⅡ),插入腺相关病毒载体psNAV中(pAarⅡ)。将该质粒通过脂质体稳定转染Heda细胞(pAar Ⅱ H),检测其表面HLAⅡ分子表达,并以RT-PCR检测其CⅡTA、HLA-Ⅱ(DR、DP及DQ)及Ii分子的mRNA水平。结果:pAarⅡH在重组人IFN-γ诱导下,DR、DP及DQ抗原表达分别降低了79±12%、90±15%及40±8%;同时HLA-Ⅱ及Ii分子的mRNA被明显抑制。结论:提示CⅡTA反义基因片段抑制了自身组成型及诱导型表达量,并相应阻止了CⅡTA所调控的基因(HLA-Ⅱ及Ii)的表达,从而为进一步探讨免疫耐受形成及其在组织工程中的应用奠定了基础。

反义hTRT转染对SGC-7901胃癌细胞株形态学的影响

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位 (hTRT)反义基因转染对SGC 790 1胃癌细胞株形态学的影响 ;方法 采用脂质体法将hTRT正、反义真核表达载体导入SGC 790 1胃癌细胞株中 ,从光镜、电镜水平观察转染细胞形态学的变化。结果 与未转染细胞相比 ,光镜下hTRT反义基因转染的SGC 790 1胞体增大 ,胞浆丰富 ,分裂相减少 ,核浆比增大 ,异型性减小 ;透射电镜下反义基因转染细胞细胞器丰富 ,胞浆内出现分泌泡样结构及胞质内微囊 ;扫描电镜下反义基因转染细胞表面微绒毛增多 ,胞体周围可见大量颗粒样物质 ,根据AB/PAS染色结果 ,这些颗粒样物质有可能是其分泌的粘液颗粒。结论 hTRT反义基因有促进SGC 790 1细胞分化的作用。

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肺癌细胞转染

目的 :构建正义和反义人肝素酶与绿色荧光蛋白真核共表达载体 ,并分别转染人低转移肺癌细胞株 95C及高转移细胞株 95D .方法 :采用基因重组技术 ,用EcoRⅠ从pcD NA3 Hpa质粒上切下约 1 .7kb的人肝素酶全长cDNA片段 ,然后连入pIRES2 EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上 ,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体 ,并用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肺癌细胞株 95C、反义真核表达载体转入人高转移肺癌细胞株 95D ,G4 1 8筛选后 ,荧光倒置显微镜检测转染结果 .结果 :经BamHⅠ酶切后 ,正义质粒形成 5 .3+1 .7kb两条DNA片段 ,而反义重组质粒为 6 .5和 0 .5kb两条DNA片段 ,与理论计算值完全一致 ;转染后肺癌细胞倒置荧光显微下呈绿色荧光 .结论 :成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体 ,并成功转染人低、高转移肺癌细胞株 ,为进一步研究正。

反义T-STAR基因转染降低肺腺癌A549细胞端粒酶活性

目的 通过反义技术抑制肺腺癌A5 49细胞T STAR (testes signaltransductionandactivatorofRNA)基因内源性表达,观察对细胞端粒酶活性的影响。方法 用阳性脂质体法将T STAR反义基因转染入A5 49细胞,用RT PCR及Westernblot方法检测转染细胞内源性T STAR基因mRNA和蛋白表达水平,并用PCR ELISA法检测细胞端粒酶活性改变。结果 反义基因可在mRNA及蛋白水平有效抑制肺腺癌A5 49T STAR基因的表达,同时明显降低细胞端粒酶活性。结论 肺腺癌A5 49细胞T STAR基因表达的抑制可能下调端粒酶活性。

反义MCP-1转染兔平滑肌细胞及对其生长的影响

构建逆转录病毒载体反义单核细胞趋化蛋白1（LUCX-Anti-MCP－1）表达质粒，利用阳离子脂质体（Lipofectamine）将反义MCP－1导入体外培养的平滑肌细胞，通过PCR、Northern杂交检测外源基因的转染及其mRNA表达情况。应用3H胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）掺入法了解反义MCP－1基因对细胞生长的影响．结果显示：Lipofectamine可以成功的将反义MCP－1基因导入体外培养的主动脉平滑肌细胞中，并实现外源基因的转录表达。且反义MCP－1基因对体外培养的平滑肌细胞生长没有影响。

端粒酶RNA反义基因对肝癌细胞的影响

用RT-PCR的方法钓取端粒酶RNA基因的cDNA,并将其反向插入到逆转录病毒载体pLNCX上,构建hTR基因的反义表达质粒。将质粒经脂质体介导转染人肝癌SMMG-7721细胞中表达。结果表明hTR反义基因的表达有效地封闭或抑制肝癌细胞的端粒酶活性,抑制细胞的生长和增殖,延长细胞的倍增时间并促进细胞凋亡。

c-fos反义基因对缺血缺氧心肌细胞肌钙蛋白表达的影响

目的探讨cfos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞肌钙蛋白表达的影响。方法烧伤血清采自30%TBSAⅢ度烫伤Wistar大鼠:采用含1%O2的混和气体作为缺氧模型;采用基因重组技术构建cfos反义基因重组体;由LipofectamineKit介导心肌细胞转染;于缺氧复合烧伤血清处理1,3,7h不同时相点采用Westernblot检测cfos蛋白,肌钙蛋白T(TnT)的表达变化。结果加入烧伤血清并造成缺氧的非转染心肌细胞(简称非转染组),cfos蛋白显著表达,3h达到最高峰,与正常对照组比较,TnT表达显著下降,7h降至最低水平;转染cfos反义基因重组体(简称转染组)后,cfos蛋白表达显著下降,TnT表达却显著回升。结论缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞TnT表达较正常心肌细胞明显减少,当在缺氧复合烧伤血清处理前转染cfos反义基因后,心肌细胞TnT表达较单纯缺氧复合烧伤处理心肌细胞显著回升,表明cfos反义基因转染能抑制心肌细胞TnT的表达下降。

转化生长因子α反义RNA对人脑胶质瘤细胞系BT_(325)的生长抑制和诱导分化作用

转化生长因子α（TGFα）以自泌和旁泌的形式与肿瘤细胞表面表皮生长因子受体（EGFR）结合,在肿瘤的发生发展中起着重要作用。阻断这种自泌和旁泌体系可能对肿瘤细胞产生影响。为此我们构建了含TGFα反义基因的逆转录病毒重组载体并将其导入人脑胶质瘤细胞系BT325中,成功地表达了TGFα反义RNA。在反义RNA作用下,肿瘤细胞发生了显著变化,结果如下:

反义基因转染抑制骨肉瘤中血管内皮生长因子表达的研究

目的 观察以腺相关病毒 (rAAV)为载体的血管内皮生长因子 (VEGF)反义基因转染的骨肉瘤细胞中VEGF蛋白的表达。方法 用不同量 (0、2 0、5 0、10 0、2 0 0、2 40 μl)的以rAAV为载体包装的反义VEGF基因 (rAAV antiVEGF)转染人骨肉瘤细胞系MG 63细胞 ,收集转染前后的培养细胞及上清 ,用链霉素抗生素蛋白 过氧化酶连接法 (SP)和免疫印迹法 (Western blot)检测VEGF蛋白的表达 ;用逆转录聚合酶链式反应 (PCR)检测VEGFmRNA表达。结果 SP结果表明转染rAAV antiVEGF基因的量越多 ,显色越淡 ;Western Blot结果表明转染rAAV antiVEGF基因的量越多 ,其灰度越低。测得不同量 (0、2 0、5 0、10 0、2 0 0、2 40 μl)的转染基因其相应的吸光度值分别为 86614± 13 776、73 2 45± 15 414、610 78± 12 12 4、5 465 7± 10 95 3、3 980 2± 113 0 8、3 2 0 14±15 0 5 7,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;PCR检测其灰度值分别为 0 .986、0 .913、0 .784、0 .60 6、0 .43 1、0 .40 8,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论 rAAV antiVEGF可封闭VEGFmRNA ,使已转染rAAV antiVEGF的MG 63细胞表达的VEGF蛋白减少。

人胰岛素样因子Ⅱ型受体反义基因转染对肝癌细胞生长的影响

目的 研究人胰岛素样生长因子Ⅱ型受体 (IGF ⅡR)反义基因对SMMC 772 1人肝癌细胞生长的抑制作用。方法 构建IGF ⅡR正、反义基因真核表达质粒 ,用磷酸钙 DNA共沉淀的方法 ,导入SMMC 772 1人肝癌细胞株 ,经G418培养液筛选稳定的抗性细胞。采用Northern杂交检测对转染细胞内源性IGF ⅡR基因转录的作用 ,观察转染细胞克隆形成率 ,细胞生长曲线 ,软琼脂生长能力的变化。结果 IGF ⅡR反义基因转染肝癌细胞的内源性IGF ⅡR基因转录受到有效抑制 ,转染细胞克隆形成率明显降低 ,并失去在软琼脂上生长能力 ,但细胞生长曲线无明显变化。结论 IGF ⅡR反义基因可有效阻断IGF Ⅱ至IGF ⅡR的自分泌 /旁分泌生长刺激信号环路 ,一定程度抑制肝癌细胞的恶性表型。

c-jun反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清刺激下大鼠心肌细胞的保护作用

目的 观察c jun反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清刺激下大鼠心肌细胞的保护作用。 方法 培养大鼠心肌细胞 ,分为 :(1)正常对照组 ;(2 )转染组 :构建c jun反义基因重组体并转染入心肌细胞 ,随后进行缺氧复合烧伤血清刺激 ;(3)非转染组 :仅进行缺氧复合烧伤血清刺激 ,不作其他处理。于刺激后 1、3、7h,采用逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)检测c junmRNA的表达变化 ;用Westernblot检测c jun蛋白、肌钙蛋白T(TnT)和 β 微管蛋白的表达变化 ;在光镜和电镜下观察心肌细胞形态结构改变。 结果 (1)与正常对照组比较 ,非转染组c junmRNA与蛋白表达显著 ,转染组较非转染组显著下降。 (2 )与正常对照组比较 ,非转染组TnT与 β 微管蛋白表达显著下降 ,转染组较非转染组明显回升。 (3)转染组心肌细胞骨架结构基本保持完好 ,偶见断裂与溶解。非转染组骨架网状结构紊乱、溶解与断裂 ,呈颗粒状。 结论 缺氧复合烧伤血清刺激可使大鼠心肌细胞c jun表达上调 ,进而引起心肌细胞损伤 ,c

转染人高迁移率族蛋白1反义基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨反义高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法 应用分子克隆技术构建反义HMGB1基因真核表达载体pcDNA3 1/anti HMGB1,用脂质体法将其导入人胰腺癌细胞PANC 1中,经G4 18筛选获得可稳定表达反义HMGB1的人胰腺癌细胞克隆,通过逆转录聚合酶链反应、免疫印迹法和噻唑蓝比色法检测转染4 8h后胰腺癌细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期情况。结果 获得了pcDNA3 1/anti HMGB1真核表达质粒,pcDNA3 1/anti HMGB1转染可使PANC 1细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低(P <0 .0 1)、肿瘤细胞增殖能力明显受到抑制(P <0. 0 1) ,并出现细胞周期G1期阻滞、凋亡细胞百分数增加。结论 反义HMGB1基因的表达能有效抑制胰腺癌细胞的体外增殖并促进细胞凋亡。

c-jun反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞保护作用的分子机制研究

目的 探讨c -jun反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞保护作用的分子机制。方法 烧伤血清采自3 0 %TBSAⅢ度烫伤Wistar大鼠 ;采用含 1%O2 的混和气体作为缺氧模型 ;采用基因重组技术构建c -jun反义基因重组体 ;由Lipo fectaminekit介导心肌细胞转染 ;缺氧复合烧伤血清处理后 12、2 4和 48h不同时相点采用Westernblot检测c -jun蛋白 ,PKCα和JNK的表达变化。结果 加入烧伤血清并造成缺氧的非转染心肌细胞 (非转染组 ) ,c -jun蛋白 ,PKCα和JNK均显著表达 ,2 4h达最高峰 ;转染c -jun反义基因重组体 (转染组 )后 ,c -jun蛋白 ,PKCα和JNK表达均明显下降。结论 c

高迁移率族蛋白框1反义核酸抑制人胰腺癌细胞系PCNA-1侵袭的研究

背景与目的:研究证明高迁移率族蛋白框1(highmobilitygroupbox1,HMGB1)在大多数未成熟及恶性肿瘤细胞中高表达,它与细胞增殖、侵袭、转移有密切关系。我们前期的研究证明HMGB1在胰腺癌组织中高表达并与肿瘤的侵袭及转移显著性相关。本研究的目的是观察HMGB1反义核酸对胰腺癌PCNA-1细胞体外侵袭能力的影响,并探讨其作用机制。方法:以脂质体介导方法将HMGB1反义表达载体转染胰腺癌细胞株PCNA-1,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测HMGB1、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase-2,-9,MMP-2,MMP-9)mRNA的表达,Westernblot法检测HMGB1蛋白表达,明胶酶谱法(gelatinzymography)检测MMP-2和MMP-9活性的变化,Boyden小室法检测PCNA-1的体外侵袭能力。结果:HMGB1反义核酸明显抑制PCNA-1细胞HMGB1mRNA和蛋白的表达。转染后,MMP-2及MMP-9mRNA表达和酶活性亦受到显著抑制(P<0.01)。另外,HMGB1反义核酸的导入显著减弱了胰腺癌细胞的跨膜侵袭能力(P<0.01)。结论:HMGB1在胰腺癌侵袭转移中,阻断HMGB1基因的表达,可能是阻抑胰腺癌转移的一种新策略。

OPN反义真核表达载体的构建及其对肾癌细胞增殖侵袭的影响

背景与目的:骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的过表达和多种恶性肿瘤的发展和转移密切相关,然而,在肾癌中OPN所扮演的角色尚未被清楚地阐明。为验证其作为肾癌基因治疗靶点的可行性,本研究通过构建获得OPN反义基因真核表达载体转染人肾癌ACHN细胞,观察其对人肾癌细胞增殖及侵袭的影响。方法:提取ACHN细胞总RNA,RT-PCR法扩增获得OPN目的片段,将其反向克隆到pcDNA3.1(-)质粒中构建OPN反义真核表达载体,并转染人肾癌ACHN细胞。采用半定量RT-PCR法和Western印迹法检测OPN mRNA及蛋白的表达情况;MTT法检测对细胞的生长抑制作用;流式细胞术检测对细胞周期和凋亡率的影响;软琼脂克隆形成实验和Transwell法分别检测细胞的增殖和侵袭能力。结果:RT-PCR检测OPN mRNA表达量结果显示,转染重组质粒细胞中的OPN mRNA的表达量为0.29±0.04,与转染空质粒细胞的0.86±0.05和未转染细胞的0.88±0.04相比,差异有统计学意义(P<0.05)。MTT法检测结果显示ACHN/OPN细胞的生长速度受到抑制;流式细胞检测结果显示ACHN/OPN细胞生长停滞于S期且凋亡率明显升高;软琼脂克隆形成实验及Transwell实验结果显示细胞的增殖和侵袭能力下降(P<0.05)。结论:OPN在肾癌ACHN细胞的增殖和侵袭过程中发挥了重要作用,反义OPN基因能抑制肾癌细胞的恶性表型。