应用H1-U6双启动子RNAi载体筛选人泛素结合酶hUBE2W的RNAi有效靶点

hUBE2W是新近鉴定出的一种I型泛素结合酶,可能在肿瘤发生和DNA损伤修复过程中起重要作用。RNA干涉是指通过形成局部双链RNA进而特异性地降解细胞内同源基因mRNA的机制,目前已成为基因功能研究的有力工具。通过构建H1-U6双启动子RNAi载体,可以在体内直接转录出针对hUbe2w基因的两段互补小RNA,更接近于生理状态下小干涉RNA的作用。利用RT-PCR方法从293FT细胞总RNA中扩增出hUbe2w基因,分别将其连接至质粒pGL3-Control、pCMV-myc和pDsRed-express-C1中,以便在mRNA水平和蛋白水平检测RNA干涉效果。RNA干涉载体分别与上述报告载体共转染293FT细胞,测定萤光素酶活性和hUBE2W蛋白表达水平,结果显示靶点125和259能够在mRNA水平和蛋白质水平显著降低hUbe2w的表达。