山蛭素(haemadin)在毕赤甲醇酵母中的表达及其性质鉴定

人工合成山蛭素基因后,利用基因重组的方法将山蛭素的基因克隆到pPicZαA载体,经过线性化,电转至毕赤酵母GS115中表达。使用浓度高达1500μgmL的zeocin筛选得到高拷贝插入的GS115H菌株,经过优化摇瓶表达条件表达量达到100mgL。摇瓶培养物经离心取上清,分别使用3kD和10kD的超滤膜超滤,阳离子交换层析和凝胶过滤层析等纯化步骤之后,得到纯度高于95%的目的蛋白,产出量为40mgL,回收率为40%。通过以chromozymTH为底物的凝血酶酰胺水解实验证实了其体外生物学活性:其抑制凝血酶常数为(2.46±0.13)×10-13molL。

山蛭基因组DNA的提取及其PCR扩增产物的分析

利用PCR技术从海南山蛭体内分离山蛭素 (抗凝血蛋白 )基因 ,首先需获得不带有山蛭体表色素且完整的山蛭基因组DNA ,本试验通过结合使用SDS-蛋白酶裂解法和CTAB法 ,有效的去除了山蛭基因组DNA提取过程中难以去除的色素 ,得到的基因组DNA保持完整 ,无降解。以之作为模板 ,进行PCR扩增 ,获得一个长度约为 2 37bp的特异性片段 ,此片段与印度山蛭蛭素的cDNA大小几乎一致。初步表明 ,这个序列没有内含子 。

山蛭素Hs基因在甲醇毕赤酵母中表达

【目的】山蛭素基因在甲醇毕赤酵母中表达。【方法】利用PCR点突变方法改造山蛭素基因 ,将山蛭素基因克隆到pGEM Teasy载体中。对重组质粒测序 ,构建了毕赤酵母表达载体 pPIZB Hs ,然后转化有活性的GS115酵母菌株 ,筛选表达酵母菌株GS115 ,摇瓶发酵。【结果】改造的山蛭素基因在重组酵母中表达 ,重组蛋白质具有对凝血酶抑制活性。【结论】利用PCR点突变方法能改造山蛭素基因 。

海南山蛭蛭素基因的克隆和序列分析

以海南山蛭(Haemadipsahainana)基因组DNA为模板,以合成的2段30个寡聚核苷酸的序列为引物,经过PCR扩增,分离海南山蛭中的蛭素基因,获得了1条大小约237 bp的DNA片段。将其克隆到pGEM-Teasy载体中,经筛选与检测,并进行序列分析。结果显示,所克隆的海南山蛭蛭素基因的大小为231 bp,与Dr. Burkhard报道的印度山蛭蛭素cDNA序列相比,其核苷酸的同源性为99.9%。

含RGD序列的山蛭素突变体的克隆、表达及性质研究

根据LAP (leechantihemostaticprotein)理论 ,在分析山蛭素和decorsin结构特征的基础上 ,利用重组PCR方法 ,删除了山蛭素氨基酸序列的 33位至 35位 ,同时分别插入了RGDS和来源于decorsin的一段PRGDADP序列构建成为 2种含RGD序列的山蛭素突变体 ,分别命名为HRGD1和HRGD2 .这 2种突变体在毕赤酵母菌株GS115中得到成功表达 .经过超滤、阳离子交换层析和凝胶过滤层析等纯化步骤之后 ,得到纯度高于 95 %的目的蛋白 .通过以chromozymTH为底物的凝血酶酰胺水解实验和血小板聚集抑制实验证实了其体外生物学活性 ,HRGD1和HRGD2抑制凝血酶的动力学常数达到 10 -13 mol/L水平 ,抑制血小板的IC50 在 10