冷鲜牛肉中蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei)的分离与鉴定

在出口冷鲜牛肉的沙门氏菌检验过程中,从HE琼脂平板上分离到1株蜂房哈夫尼亚菌,该菌三糖铁斜面产碱,底层产酸,不产生H2S,不产气,革兰阴性。经BBL Crystal微生物半自动检测仪检测,同时结合伯杰细菌鉴定手册的生化试验结果鉴定为蜂房哈夫尼亚菌（Hafnia alvei）。

Linalool against Hafnia alvei,its antibacterial mechanism revealed by metabolomic analyses

Linalool,a major component of aromatic plant essential oils,has an antibacterial effect against Hafnia alvei,which can induce food spoilage.In this study,we aimed to investigate the antibacterial effect and mechanism of linalool against H.alvei.Linalool treatment resulted in excessive reactive oxygen species(ROS)accumulation,which resulted in destruction of the cell membrane.According to the field emission scanning electron microscopy(FESEM)and flow cytometry(FCM)results,it was confirmed that the membrane structure of H.alvei was destroyed.Moreover,metabolomics analysis showed that there were 64 and 73 differentially expressed metabolites screened by mass spectrometry in positive and negative ion modes,respectively,suggesting that nucleic acid metabolism,the respiratory chain and energy metabolism were negatively affected by linalool.Biochemical validation confirmed that the activities of malate dehydrogenase(MDH),and succinate dehydrogenase(SDH)and respiratory metabolism were reduced after linalool treatment.It was therefore concluded that the cell membrane was damaged,nucleic acid metabolism was disturbed,and energy metabolism was reduced by inhibition of the respiratory chain and tricarboxylic acid(TCA)cycle.These results revealed the antibacterial mechanism of linalool against H.alvei,and support the use of linalool as a potential natural preservative to control H.alvei.

赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质

考察了蜂房哈夫尼菌(H.alveiAS1.1009)的L-赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸的脱羧作用,分析了培养基、温度、pH、激活剂等因素对酶活力的影响。实验结果表明,最适培养基成分为:ρ(蔗糖)=20 g/L、ρ(玉米浆)=20g/L、ρ(酵母膏)=5 g/L、ρ(牛肉膏)=3 g/L、ρ(蛋白胨)=10 g/L、ρ(氯化钠)=5 g/L、ρ(硫酸铵)=2 g/L、ρ(维生素B6)=5 g/L和ρ(L-赖氨酸)=5 g/L,100 mL发酵液中接种量为5 mL液体菌种。最佳转化工艺条件为:转化体系温度35℃、pH=5.0,ρ(菌体)=10 g/L,ρ(吐温-80)=0.15 g/L。L-赖氨酸脱羧酶在最适发酵和转化条件下比酶活可达7 984.43 U,底物转化率可达70%。

不同培养条件及群体感应信号分子对蜂房哈夫尼亚菌生物被膜的影响

为研究蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei)Ha-01生物被膜形成的过程及不同培养条件(碳源、p H值、Na Cl质量分数、黏附材料)对其生物被膜形成的影响,采用超声波平板法及扫描电镜法研究不同培养条件下菌株Ha-01生物被膜活菌数及生长情况,并通过添加外源标准群体感应信号分子(N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs))中的C6-HSL研究了AHLs与其生物被膜形成的关系。结果显示,菌株Ha-01生物被膜的形成与培养时间密切相关;在不同碳源的培养条件下形成生物被膜能力不同,其中在以木糖为培养基时形成量最大,达到7.51(lg(CFU/cm^2)),与在LB培养基中相比增加10.28%;在中性培养条件下更利于其生物被膜的形成,活菌数为7.77(lg(CFU/cm^2));在Na Cl质量分数为2%时,其生物被膜产生量最大,活菌数为7.18(lg(CFU/cm^2));在不同黏附材料上生物被膜形成能力从大到小依次为铝片、锌片、玻璃片,活菌数分别为7.22、6.48、6.11(lg(CFU/cm^2));且添加C6-HSL量越多,其生物被膜产生能力越强。研究表明,培养条件能够影响菌株Ha-01生物被膜形成,且AHLs可以调控其生物被膜形成。

源自轻腌大黄鱼的特定腐败菌特性及腐败能力

为探究轻腌大黄鱼优势腐败菌的基本特征和腐败能力,以源自冷藏轻腌大黄鱼的普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌为对象,分析两株菌的表型、生理生化、碳源代谢和细胞磷脂脂肪酸组成等特征;将其分别接种到无菌轻腌鱼块中,分析冷藏(5℃)过程中感官、微生物和理化等指标变化,评价和比较两者的腐败能力。结果表明,两株菌在低盐(NaCl质量分数不大于4%)和pH 5~7下均能够生长,对碳源的总体利用情况和优势磷脂脂肪酸成分相似。接种普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌的鱼块货架期分别为12 d和14 d,腐败终点菌落总数分别为(8.90±0.73)(lg(CFU/g))和(8.70±0.92)(lg(CFU/g)),产量因子YTVB-N/CFU分别为3.61×10-8 mg/CFU和3.71×10-8 mg/CFU,尸胺含量均大于腐胺含量,醇类和醛类为腐败鱼块的主要挥发性成分。综上,普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌生理生化特征存在一定差异,普通变形杆菌的腐败能力强于蜂房哈弗尼菌。本实验可为轻腌大黄鱼的工艺优化、靶向抑菌及延长产品货架期提供理论依据。

一株与侵袭性大肠埃希菌O144诊断血清交叉凝集的蜂房哈夫尼亚菌

[目的]对试验中发现的一株与EIEC诊断血清O144:K?发生凝集反应的蜂房哈夫尼亚菌进行较详细的生化与血清学鉴定,为今后的相关细菌鉴定工作提供参考。[方法]参考国家食品卫生检验标准微生物分册GB/T4789-2003、临床微生物手册中的相关方法进行。[结果]该蜂房哈夫尼亚菌菌株生化不典型,且与EIEC O144:K?血清型存在交叉凝集反应。[结论]该菌株为蜂房哈夫尼亚菌中少数的、生化不典型的菌株,若不进行较详细的生化鉴定易误检为EIEC O144:K?。

L-赖氨酸脱羧酶活力测定方法的研究

以蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)为基础,进行L-赖氨酸脱羧酶活力的研究。对酶活测定过程中影响酶活力的三个主要因素:生物量,转化时间和初始底物浓度进行了选择和优化。最终确定了一种较为简便的L-赖氨酸脱羧酶活力的测定方法,即:调整发酵液的初始OD620=6(稀释10倍),补加200 g/L的L-赖氨酸母液至20 g/L,35℃静置转化3 h,测定L-赖氨酸的消耗量。酶活定义为:在35℃下,在1 min内能转化1μg L-赖氨酸的酶量为1个活力单位。本方法操作简单,无污染,且检测结果准确可靠(r=0.9901),稳定性良好(RSD=5.07%)。

响应面法优化赖氨酸脱羧酶产酶培养基

目的:对蜂房哈夫尼菌产L-赖氨酸脱羧酶培养基进行优化。方法:采用响应面优化的方法。首先单因素实验得到最适培养基成分为:葡萄糖2%,酵母膏2%,MgSO40.03%,KH2PO40.01%,NaCl 0.3%,L-赖氨酸0.5%,维生素B60.1%,玉米浆4%,酶活达到180.85U/mL。在此基础上,用PB试验筛选出对酶活影响显著的3个因素(葡萄糖、酵母膏、玉米浆),再通过Box-behnken实验对这三个因素进行优化。结果:得到产酶最佳培养基为葡萄糖1.84%,酵母膏2.20%,玉米浆3.66%,MgSO40.03%,K2HPO40.01%,NaCl 0.3%,L-赖氨酸0.5%,维生素B60.1%。结论:响应面优化的方法使酶活达到203.14U/mL,比优化前的比酶活(7.03U/mL)提高28.9倍,在单因素的基础上提高了11.3%。

通过DNA改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc

利用DNA改组技术对赖氨酸脱羧酶野生型基因ldc进行随机突变,在大肠杆菌Escherichia coli JM109中构建赖氨酸脱羧酶突变体库。从E.coli JM109和蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009中分别克隆出赖氨酸脱羧酶基因cad A和ldc。查询NCBI数据库得知,二者的同源性为75%。分别构建重组质粒p Trc99a-cad A和p Trc99a-ldc,以此2种质粒为模板,经PCR扩增,获得目的基因片段,分析目的基因片段中存在的限制性酶切位点,用多种限制性内切酶碎片化2种基因,切割成不同大小的片段。这些小片段进行不同组合,突变体经过LBXL平板初筛和高效液相色谱(HPLC)复筛,获得1株酶活性提高的赖氨酸脱羧酶突变体,编号为LDC2-16,其比酶活为4 869.86 U/mg(以1 mg总蛋白计),与2种野生型赖氨酸脱羧酶基因表达的酶Cad A(1 652.63 U/mg)、Ldc(2 365.93 U/mg)相比,在最适温度37℃、p H 6.0时,突变体的比酶活分别是上述野生型酶的2.95和2.06倍。摇瓶发酵5 h后,目标产物1,5-戊二胺产量从46.9提高至63.9 g/L,提高了36%。

海产品中蜂房哈夫尼菌的鉴定及相关特性研究

从蜢虾酱和鱼露中分离出3株和1株细菌,命名为G1、G4、G5和Y1。经16S rRNA序列分析和相关生理、生化鉴定,4株菌均为蜂房哈夫尼菌。为探究海产品中蜂房哈夫尼菌的腐败相关特性,测定这4株以及另分离自腐败即食海参和大菱鲆的2株蜂房哈夫尼菌生物被膜的形成、泳动性、耐盐性、耐药性、TVB-N值和生物胺产生能力等相关特性。结果表明,6株蜂房哈夫尼菌具有较强的耐盐度,均在0.05 g/mL以上,培养一定时间后形成中等强度以上的生物被膜,并可在泳动性培养基表面扩散,表明其具有泳动性。该菌具有广泛的抗药性,对氨苄青霉素、壮观霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶等抗菌药物有不同程度的抗性,然而对庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素、氧氟沙星、环丙沙星和呋喃唑酮较为敏感。将6株菌分别接种到其相应来源的海产品后,其TVB-N值随着贮藏时间的延长而明显增加。此外,6株蜂房哈夫尼菌均能产生3种生物胺,分别为腐胺、尸胺和组胺,并且产生腐胺和尸胺的能力明显高于组胺,说明蜂房哈夫尼菌具有腐败特性,在海产品腐败过程中起重要作用。本研究在探索蜂房哈夫尼菌导致的海产品腐败方面具有重要意义。

一例水貂感染蜂房哈夫尼菌的分离鉴定及药敏试验

为了对某发病水貂场的病死水貂进行病原学诊断,采用病原分离、生化试验、PCR扩增、基因序列比对等方法对分离细菌进行了鉴定,最终确定其病因为蜂房哈夫尼菌感染。在此基础上进行了药敏试验,发现蜂房哈夫尼菌对大多数药物敏感。

蜂房哈夫尼菌群体感应对其生物膜及泳动性的调控作用

在腐败即食海参中分离腐败菌蜂房哈夫尼菌H4(Hafnia alvei H4),研究其群体感应对生物被膜的形成以及泳动性的调控作用。采用基因敲除方法构建群体感应基因luxR和luxI缺失型菌株?luxRI,并采用结晶紫染色的方法测定其生物膜形成的变化,进一步采用扫描电镜对其生物膜进行观察,同时运用平板扩散的方法测定其泳动性的变化,实时聚合酶链式反应法检测生物膜相关基因flgA、flgE、fliA、flhD和flhC相对表达量的变化。研究表明:lux RI基因缺失后,不影响H. alvei H4的生长,但不能分泌高丝氨酸内酯类信号分子。除此之外,?lux RI菌株生物膜的形成显著降低(P<0.05),扫描电镜结果显示黏附到介质上的菌落数明显减少,且其在介质表面分泌的胞外多糖形成的网状结构物明显少于野生型菌株。?lux RI菌株泳动能力明显减小(P<0.05),flgA、flgE、fliA、flhD和flhC基因的相对表达量亦出现显著下调(P<0.05)。结果表明H. alvei H4的生物膜的形成和泳动性受到群体感应系统的调控。

白藜芦醇对蜂房哈夫尼菌生物膜形成的影响

为研究白藜芦醇对水产品优势腐败菌蜂房哈夫尼菌生物膜形成的影响,检测了白藜芦醇对紫色杆菌CV026中紫色杆菌素产量的影响以及对蜂房哈夫尼菌生物膜形成能力的抑制作用。结果表明,与未处理的对照组相比,白藜芦醇能够显著抑制由群体感应控制的紫色杆菌CV026中紫色杆菌素的产量而不抑制其生长,抑制率达74.9%。白藜芦醇以浓度依赖的方式抑制蜂房哈夫尼菌游动能力(74.1%)和生物膜的形成(79.1%),表明白藜芦醇可能作为一种群体感应抑制剂或抗生物膜制剂来控制食品腐败,从而提高食品安全性。

二烯丙基二硫醚对蜂房哈夫尼菌群体感应的抑制作用

以从海参中分离的优势腐败菌蜂房哈夫尼菌为对象,研究了二烯丙基二硫醚(DADS)对受其群体感应调控的生物膜及泳动性的抑制作用。采用CV026报告菌定性检测DADS的抗群体感应活性,利用96微孔板法、扫描电镜(SEM)和琼脂扩散法分析DADS对蜂房哈夫尼菌生物膜及泳动性的抑制作用。结果表明,DADS作用于蜂房哈夫尼菌和CV026的最低抑菌浓度是48 mmol/L。在亚抑菌浓度下,与未处理对照组相比,DADS能够抑制由群体感应调控的CV026中紫色素的分泌而不抑制其生长。在0~12 mmol/L,随着浓度增加,DADS对生物膜的抑制率可达49.6%,对泳动性的抑制率达到73.5%。在12 mmol/L时,DADS能够抑制生物膜的形成。DADS能够抑制蜂房哈夫尼菌的群体感应活性、生物膜及泳动性,从而发挥防腐功效。

蜂窝哈夫尼亚菌脂多糖核心区的免疫学特征

用单克隆抗体和多克隆抗血清对８株Ｈａｆｎｉａａｌｖｅｉ（Ｈ．ａｌｖｅｉ）的脂多糖核心区进行了测定，结果如下：①用ＫＤＯ－特异性单克隆抗体（克隆１４和２０）分别在６株和５株Ｈ．ａｌｖｅｉ的脂多糖中检测到α－连接的ＫＤＯ侧链，②Ｅ．ｃｏｌｉ核心型（Ｒ＿１～Ｒ＿４）特异性单克隆抗体和吸收后单一特异性抗血清均不能与Ｈ．ａｌｖｅｉ的脂多糖核心发生反应。③Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｒｃ（化学型）核心特异性单克隆抗体（ＷＮ１２２２－５）能与所有（８株）测试的Ｈ．ａｌｖｅｉ的脂多糖发生反应。结果表明，Ｈ．ａｌｖｅｉ含有类似于Ｅ．ｃｏｌｉ－ＫＤＯ侧链和Ｒｃ（化学型）核心的抗原结构，但两者己糖区核心型（Ｒ＿１～Ｒ＿４）抗原不同。

NaCl和pH对普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌碳源代谢能力的影响

本文以轻腌大黄鱼优势菌(普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌)为研究对象,利用BIOLOG分析了两种菌在5℃条件下,不同NaCl浓度和pH水平胁迫对其碳源代谢的影响,通过丰富度指数、孔平均颜色变化率及利用面积,结合主成分分析法评价其碳源代谢能力。结果表明,普通变形杆菌和蜂房哈弗尼菌利用的碳源种类均以糖类为主,其他依次为羧酸类、氨基酸类和己糖磷酸类。NaCl浓度对两株菌的碳源利用能力影响随其浓度升高而增强,NaCl增加到5%时,几乎完全抑制了两株菌对碳源的利用。pH在5.0～7.0范围内,其对两株菌的碳源利用抑制效应随p H降低而增大,但总体抑制效应不显著。结论:NaCl浓度的增加能够逐渐抑制两株菌的碳源代谢,增加到3%时几乎完全被抑制,在pH5.0～7.0的范围内,对两株菌的碳源代谢影响不大。

贵州中蜂蜂房哈夫尼菌的分离鉴定及药敏试验

为准确诊断贵州某蜂场发生的细菌性中蜂疾病,并提供防制方案,本试验进行了细菌分离纯化、形态学观察、生化试验,应用细菌16SrRNA基因通用引物进行基因扩增测序,测序结果在NCBI上进行比对分析,选取同源性较高的5个属的30株细菌的16SrRNA序列进行同源性分析并构建系统进化树,并对该分离菌进行动物回归试验和药敏试验。结果显示,分离菌为革兰氏阴性短杆菌,生化试验初步鉴定为蜂房哈夫尼菌;16SrRNA序列与哈夫尼杆菌属同源性最高,在97.0%~99.6%之间;遗传进化树表明,分离菌在哈夫尼菌菌属这一分支;动物回归试验显示,分离菌对中蜂有一定致病性,表明该蜂场受到蜂房哈夫尼菌感染,造成了蜜蜂的副伤寒;药敏试验结果表明,分离菌对青霉素、红霉素、克林霉素等耐药,对阿米卡星、复方新诺明、氧氟沙星等敏感。本试验结果为中蜂感染蜂房哈夫尼菌病的研究提供了一定参考,并能对蜂场提供合理用药意见。

水分活度对轻腌大黄鱼源蜂房哈夫尼菌碳源利用能力的影响

为探究水分活度(water activity,A w)对轻腌大黄鱼源蜂房哈弗尼菌碳源代谢的影响,利用Biolog GENⅢ微孔板测定25℃、不同A w(0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98)下该菌碳源利用情况,采用修正的Gompertz模型拟合代谢曲线,获取动力学参数,结合平均颜色变化率及利用面积,探究其不同A w下碳源利用效果及动力学特征。结果表明,不同A w(0.92~0.98)下蜂房哈弗尼菌羧酸类(37.3%)和氨基酸类(32.6%)利用率均值较高,A w为0.98时菌株总体碳源利用能力最强,0.96时次之,剩余组由强到弱依次为0.95、0.92、0.93、0.94、0.97。各A w下菌株生长利用的优势单一碳源主要有L-岩藻糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖、D-葡糖醛酸、乙酰乙酸、乙酸、D-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、N-乙酰-D-葡糖胺、L-组氨酸、D-葡糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸。随着A w升高,菌株碳源利用最大比生长速率(μmax)和迟滞期(λ)分别呈现增大和减小的趋势。通过调控底物碳源及环境因子等手段,探究蜂房哈弗尼菌碳源利用和生长动力学,可为靶向抑菌及大黄鱼产品工艺优化提供一定支撑。

基于电子鼻和HPLC分析蜂房哈夫尼菌对海参腐败的影响

为研究蜂房哈夫尼菌对即食海参腐败的影响,采用微生物菌落计数、电子鼻分析和HPLC等方法,对接菌前后海参品质变化进行了分析。结果表明,蜂房哈夫尼菌可在海参基质中生长,接菌4 h进入稳定期,12 h后趋于下降,12 h的菌落数达到最高,为6.67×10^6 CFU/mL。海参基质的挥发性盐基氮在接菌后120 h质量分数为(175.3±2.9)mg/kg。接菌后的1~5 d内,海参产生了多种挥发性气体,H2S和氮氧化合物较为明显。蜂房哈夫尼菌可代谢7种氨基酸,生成对应的胺类物质,初步判定25℃是生物胺产生的最适温度,在24 h产生的腐胺量最多,为(45.85±2.9)mg/kg。研究结果表明蜂房哈夫尼菌可导致海参的腐败变质,造成品质下降,影响食用价值。

蜂房哈夫尼亚菌对粘质沙雷氏菌群体感应信号分子产生与生物被膜形成的调控

以腐败海鲈鱼中分离得到的2?株有群体感应现象的细菌为研究对象,经16S rRNA分子生物学鉴定其为蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei),命名为H. alvei-14;粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)产灵红素,命名为S.marcescens-01。研究不同培养条件下H.alvei-14与S.marcescens-01共培养后其信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoscrinc lactones,AHLs)分泌量和生物被膜产生量。结果表明:与H. alvei-14共培养能促进S.marcescens-01分泌AHLs和生物被膜的形成,这种影响可能与菌群间群体感应有关。环境条件的改变是影响细菌分泌AHLs和生物被膜形成的重要影响因子,较高盐浓度、pH值过低或过高均不利于微生物分泌AHLs和生物被膜形成,而限制性碳源及氮源等胁迫环境均可以刺激菌体群体感应系统,促进AHLs的释放和生物被膜的形成。