Harpin蛋白基因的克隆及序列分析

以梨火疫病细菌基因组ＤＮＡ为模板，通过合成５′－端及３′－端一对特异引物，利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）扩增获得ｈａｒｐｉｎ蛋白基因。将其克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ质粒上进行序列分析。结果表明：基因由１１５５个核苷酸组成，编码３８５个氨基酸残基组成的多肽。与发表序列相比较，核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为９９．３１％和９８．９６％。

产harpin的成团泛菌工程菌的构建

梨火疫病菌（ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ） 产生的胞外蛋白ｈａｒｐｉｎ 是引发其非寄主植物过敏反应的因子。ｈａｒｐｉｎ 蛋白还具有诱导植物抗性的功能。成团泛菌（ Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）３０８Ｒ 对链格胞属（ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ） 的真菌具有拮抗活性，是一株抗利福霉素的自发突变株，对壮观霉素敏感。本文通过电击转化法将带有梨火疫病菌ｈｒｐ 基因簇的重组质粒ｐＣＰＰ４３０ 导入３０８Ｒ。所得转化子具有ｐＣＰＰ４３０ 的壮观霉素抗药性标记，在番茄上引起过敏反应；从转化子中提取到与ｐＣＰＰ４３０ 大小一样的质粒，其酶切物理图谱也与ｐＣＰＰ４３０ 完全相同；用地高辛标记的ｈａｒｐｉｎ 的结构基因ｈｒｐＮ 为探针对转化子中的质粒进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析，结果在转化子中得到信号明显的杂交片段，而受体菌３０８Ｒ 中未出现杂交信号；提取细菌的外壁的蛋白质进行ＰＡＧＥ 分析，在大约４４ ｋｄ 的位置上３０８Ｒ（ｐＣＰＰ４３０） 比３０８Ｒ 明显多出１ 条带。这些结果表明成团泛菌能够表达梨火疫病菌的ｈｒｐ 基因簇，所产ｈａｒｐｉｎ

表达harpin基因的大肠杆菌DH5(pCPP430)诱导植物抗病性的研究

用表达harpin基因的大肠杆菌DHS进行了诱导植物抗病性的研究，发现表达harpin基因的重组菌除可明显诱发烟草、番茄叶片的过敏反应外，对玉米、水稻叶片也可诱发过敏反应，反应比相应阳性对照病菌速度快，坏死斑也更典型。用DHS菌悬液喷雾或注射诱导后，番茄对早疫病、水稻对稻瘟病、玉米对大、小斑病、马铃薯对软腐病的抗性均有不同程度的提高，与水杨酸诱导的抗性效果相当或比其略高。

采后Harpin处理对损伤接种苹果梨黑斑病的影响

研究harpin处理对苹果梨采后黑斑病的影响,结果表明:离体试验harpin对黑斑病没有抑制作用。经损伤的苹果梨(Pyrus pyrifolia cv. Pingguoli),用15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L的harpin溶液浸泡处理后接种链格孢(Alternaria alternata (Fr.) Keissl.),在低温条件下的贮藏结果表明:采后harpin浸泡处理可明显降低损伤接种苹果梨的黑斑病发病率,3种浓度中以30 mg/L的harpin溶液处理效果最好,而常温条件下对发病率无影响。在常温和低温条件下均可抑制病斑的扩展速度,3种浓度中以60 mg/L的harpin溶液处理效果最好。

Harpins诱导苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性防治大豆疫霉根腐病研究

为明确Harpins蛋白对大豆疫霉根腐病的抗病机制,对抗感不同大豆品种幼苗喷施Harpins蛋白,并测定喷施后120 h内大豆根系中苯丙氨酸解氨酶(PAL)的动态变化。结果表明:大豆喷施harpins蛋白后,根中PAL活性较对照增加,其中感病类型品种增加幅度较大;在喷施Harpins蛋白后120 h内,感病品种的PAL活性呈先增加后降低的趋势,并于喷施后72 h达到峰值,而抗病品种的PAL活性呈缓慢增加趋势。

采前Harpin处理对“银帝”甜瓜潜伏侵染的影响

采用50mg/L Harpin分别对“银帝”甜瓜开花前1周、幼果期、果实迅速膨大期、网纹形成期的植株进行1、2、3、4次喷洒。结果表明:Harpin可明显控制甜瓜果实的潜伏侵染。随着处理次数的增加,果实的潜伏侵染率依次降低,其中以4次处理效果最好。采前Harpin处理对潜伏于果实体内的两种优势病原菌交链孢(Alternariaalternata)和镰刀菌(Fusarrium sp.)的控制效果存在差异,对Fusarium sp.的控制效果优于A.alternata。

表达Harpin_(Ea)基因的转基因马铃薯的晚疫病抗性分析

通过根癌农杆菌介导 ,用HarpinEa基因转化马铃薯四倍体栽培种大西洋 (Atlantic) ,获得 10 7个马铃薯转化株系。经过卡那霉素的抗性鉴定和PCR分子检测 ,有 5 9株PCR检测成阳性 ,占所有转化植株的 5 5 14 % .实验对部分转基因植株进行室内抗病性评价 ,从 2 4个PCR阳性株系中筛选到 9个株系的抗病性与对照相比有显著差异 (P <0 0 5 ) ,其中 7株的抗病性与对照相比差异极显著 (P <0 0 0 1)。结果初步表明HarpinEa基因已整合到马铃薯的基因组中并得到表达 ,提高了植株的晚疫病抗性。

水稻条斑病细菌类Harpin蛋白的纯化与特性研究

用硫酸铵沉淀、制备等电聚焦电泳、阴离子交换层析等方法从水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)RS105菌株突变体M51菌体破碎液中纯化出可激发烟草产生过敏性反应(hypersensitive response,HR)的蛋白类物质,分子量约为25.5 kDa。该物质与梨火疫病菌(Erwinia amylovora))的HarpinEa和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)的HarpinXoo具有相似的生物活性和理化特性:可激发烟草产生典型的HR反应;对热稳定,对蛋白酶K敏感;RNA转录抑制剂放线菌素D、蛋白质合成抑制剂环己酰亚铵和钙离子通道阻断剂氯化镧能够抑制该物质激发烟草产生HR;该物质具有诱导烟草抗TMV的功能。据此,将该物质命名为类Harpin蛋白(Harpin-like protein,HLPxooc)。

Harpin的表达及其诱导抗烟草花叶病毒感染的活性

采用人工分段合成梨火疫病细菌(Erwinia amylovora)Harpin基因A、B、C、D片段,然后连接构建全长harpin基因,克隆到pET-23(+)表达载体中,在E.coli BL21中表达Harpin蛋白。通过His Bind Resin Ni^(++)层析柱纯化,获得Harpin蛋白。经SDS-PAGE和Western blot分析,该蛋白分子量为45kDa。采用叶片穿刺法,5μL 30μg/mLHarpin能诱发烟草叶片的过敏反应。采用叶脉注射法,5μL 30μg/mL Harpin能诱发辣椒叶片的过敏反应。将烟草和辣椒用30μg/mL Harpin喷雾处理5d后,接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),观察植株病症,并采用ELISA检测TMV含量。结果表明经Harpin处理的烟草和辣椒对TMV侵染有一定的抑制作用。

Harpins蛋白防治黄瓜霜霉病机理研究Ⅰ黄瓜接种Harpins蛋白后PAL酶活性的变化

通过分析棚室黄瓜在喷施不同浓度的Harpins蛋白后,叶片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性变化 的规律,探讨了Harpins蛋白防治黄瓜霜霉病的机理,研究结果表明:黄瓜在喷施Harpins蛋白后不同 时期PAL活性变化是不一样的,0．005g/L浓度的Harpins蛋白接种后,叶片中苯丙氨酸解氨酶(PAL) 活性变化的规律与空白对照无显著差异,0．015、0．045g/L浓度的Harpins蛋白接种后,叶片中苯丙氨 酸解氨酶(PAL)活性变化的规律与空白对照差异显著。黄瓜接种Harpins蛋白后PAL活性的变化,可 作为一种生化指标来作为Harpins蛋白防治黄瓜霜霉病的一个证据。

丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆表达与功能研究

采用PCR方法从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株中分别克隆到大小为1 026和1 038 bp的hrpZ基因(hrpZPsgA1和hrpZPsgS1),对该基因进行了原核表达和功能研究。SDS-PAGE显示其表达产物为相对分子质量62×103的融合蛋白,harpinZPsgA1和harpinZPsgS1的相对分子质量约为35×103。harpinZPsgS1的粗提蛋白经GSTrap FF纯化后质量浓度可达1.1 mg.mL-1。生物活性检测表明,该蛋白对热稳定,对蛋白酶K敏感,可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应,过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制,并且对烟草有明显的促生作用。序列比对发现,来自丁香假单胞大豆致病变种的hrpZ基因可分为2类,一类以hrpZPsgA1为代表,包括hrpZPsg12,另一类以hrpZPsgS1为代表,包括来自r0和Race4菌株的hrpZ基因。这2类hrpZ基因的核苷酸同源性为79%,氨基酸同源性为77%,均富含甘氨酸,不含半胱氨酸,与假单胞菌属以外的其他革兰氏阴性植物病原细菌harpin编码基因不存在相似性。

Harpin_(xoo)在水稻中表达提高对白叶枯病不同小种抗性

用剪叶接种法测定10个转hrf1基因水稻株系对15个水稻白叶枯病菌小种的抗性。所有的转基因系对JXOⅤ和PXO79小种的抗性与受体对照相比显著提高。RT-PCR结果显示,在转化hrf1基因的抗病水稻中,信号传导基因npr1表达明显增强。表明转hrf1基因水稻可能通过激发水稻中信号传导基因的表达,提高对白叶枯病菌不同小种的抗性。

表达Harpin蛋白的芽孢杆菌工程菌的构建及其生防效果

利用同源重组方法将来源于水稻细菌性条斑病菌的Harpin(HpaG Xooc)编码基因hpa1分别插入根围拮抗解淀粉芽孢杆菌FZB42的蛋白水解酶编码基因aprE和nprE位点,成功构建双拷贝Harpin表达工程菌株FZBHarpin。反转录PCR检测结果显示,hpa1能在RNA水平上正常转录表达。工程菌FZBHarpin发酵72 h后,其发酵液可引起烟草过敏性反应,这表明Harpin蛋白外泌胞外并保持生物活性。利用FZBHarpin浸种烟草后,烟草主根长达64.05 mm,比对照增加了30%,促生效果是FZB42的2倍。盆栽水稻白叶枯病防治试验结果显示,FZBHarpin防效为51.9%,比出发菌株FZB42防效显著提高。这为利用病原物中可激发植物产生抗病性的激发子来遗传改良生防微生物提供了理论基础。

水稻白叶枯病菌harpin基因的克隆与表达

利用 PCR方法从水稻黄单胞菌白叶枯致病变种 (Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo) Jxo III菌株中克隆到编码诱导植物过敏性反应激发子的基因 hrf A。同源性比较发现其推测产物与水稻白叶枯病菌菲律宾小种 Pxo86的 Hpa1有 97.2 %的序列一致性 ,比 Hpa1少了一个 - GGG- GG-氨基酸残基序列重复。基因经 Nde I和 Bam HI双酶切后连到含 T7启动子的高表达载体 p ET30 a(+ )上构建重组质粒 p HRF4 ,并转化宿主菌 BL2 1(DE3)产生表达菌株 BL HR4。经过 IPTG诱导之后 ,BL HR4产生一分子量为 15 .6k D的蛋白质。研究表明 ,该蛋白在性质与功能上类似于其它已发现的 harpins,即能够在烟草上引起典型的过敏性反应 ,富含甘氨酸、热稳定以及对蛋白酶敏感。因此 ,我们把该蛋白定名为 harpin Xoo。harpin Xoo还具有诱导植物抗病性的功能。

新型水稻黄单胞菌Harpin蛋白的纯化及其特性研究

报道水稻黄单胞(Xanthom onas oryzae)的两个致病变种(pv.oryzae和pv.oryzicola)所产生的Harp in蛋白.结果表明,表达菌株HRF1和HRF2分别携带两个致病变种编码Harp in的hrf1和hrf2基因.在IPTG诱导下,两个表达菌株的无细胞破碎液均具有激发烟草叶片过敏反应(HR)的活性.采用(NH4)2SO4沉淀、阴离子交换层析、Native-PAGE微量制备等方法,分别纯化出分子量为15 600和15 300,pI皆为4.5左右的单一条带;这两个单一组分符合典型Harp in蛋白的特征:可激发烟草HR,诱导烟草抗TMV,对蛋白酶K敏感、对热稳定;放线菌素D、环己酰亚胺和氯化镧等真核生物代谢抑制剂可消除它们的生物活性;琼脂双扩散试验(ODD)血清反应表明,两个Harp in蛋白有交叉反应.

SZZ-Harpin融合蛋白在苏云金芽孢杆菌中的表达及活性测定

PCR扩增编码SZZ短肽与植物过敏素 (harpin)融合蛋白的 1 5kb基因片段 ,克隆到苏云金杆菌 (Bacillusthuringiensis ,Bt)表达载体pHZB1上 ,并置于晶体蛋白cry1类基因的启动子下游 ,从而构建表达质粒pHSZH。将表达载体pHSZH电激转化晶体缺陷型的BtK CryB菌株 ,获得工程菌Bt pHSZH。SDS PAGE蛋白分析和生物测定结果显示 ,培养 4 8h的Bt pH SZH明显表达SZZ Harpin融合蛋白 。

大豆斑疹病菌harpin编码基因的克隆与特性研究

根据黄单胞菌harpin编码基因的同源性,设计简并引物,采用PCR方法从大豆斑疹病菌(Xanthomonasaxonopodispv.glycines,Xag)中克隆了402bp的hpa1同源基因,构建于表达载体pET30(a)上经转化大肠杆菌BL21菌株,获得基因工程菌BHR-3。基因工程菌诱导表达后经收集菌体和破碎细胞,得到表达产物为15.1kD的蛋白质。该蛋白质富含甘氨酸,不含半胱氨酸,对热稳定,对蛋白酶K敏感,可在非寄主烟草上激发过敏反应。激发的过敏反应需要植物体内水杨酸的积累,还可被真核生物代谢抑制剂抑制。序列比较显示,该基因与Xag中hpaG基因相同,与其它黄单胞菌中的hpa1基因有51.4%～93.8%的同源性,与其它革兰氏阴性植物病原细菌的harpin编码基因无同源性。据此把该基因产物鉴定为harpinXag。黄单胞菌harpin蛋白质序列比较发现,GG-GGG基序的多少并不是harpin蛋白的唯一特性。这为利用harpin蛋白开展植物病害控制的基因药物学设计提供了科学线索。

Harpin_(Ea)激发对不同抗性品种烟草叶片中的PAL及PPO活性的影响

以盆栽烟苗为材料 ,研究了HarpinEa激发对不同抗性品种烟草叶片中的苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、多酚氧化酶 (PPO)活性的影响 .结果表明 ,经HarpinEa激发后 ,烟草叶片中的PAL ,PPO活性变化同品种的抗感性在一定程度上相一致 ,且酶活性高峰期出现在激发处理后的第 4～ 5天 .

异源Harpin对软腐欧氏杆菌与植物互作关系的影响

本文通过三亲交配将带有梨火疫欧文氏杆菌功能完整的 hrp基因簇的重组粘粒 p CPP4 30转移到了胡萝卜软腐欧氏杆菌 (Erwinia carotovora) Se9R中。从接合子中提纯的质粒与 p CPP4 30的大小、酶切图谱相同 ;以该质粒为模板 ,用针对 hrp N序列的引物经 PCR扩增得到与 hrp N大小相同的片段 ;用地高辛标记的 hrp N作为探针进行 Southern blotting分析 ,在接合子中的质粒上得到预期的杂交带。接合子可以在烟草叶片上稳定地引起过敏反应。另外 ,接合子可以在寄主马铃薯叶片上引起过敏反应样枯斑 ,表明异源 harpin的表达及功能不受软腐菌的抑制。该接合子在体外产生的果胶酸裂解酶活性与受体菌 Se9R无明显差别。低浓度的接合子在马铃薯块茎上的软腐症状明显低于受体菌 Se9R。外源harpin表达可能不改变软腐欧氏杆菌的致病力、而是通过诱导马铃薯抗性达到减轻发病的作用。