布鲁氏菌侵染过程中has-miR-5196-3p对炎症小体的调控作用

试验旨在研究miRNA分子has-miR-5196-3p在布鲁氏菌侵染THP1细胞过程中对NOD样受体蛋白3炎症小体(NLRP3)的调控作用。运用TargetScan、MiRDB等生物信息学预测网站预测has-miR-5196-3p和NLRP3-3′UTR的结合位点,构建其野生型及突变型双荧光素酶报告载体,分别与has-miR-5196-3p mimics及阴性对照共转染293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组相对荧光素酶活性的变化,验证has-miR-5196-3p和NLRP3-3′UTR的靶向关系;布鲁氏菌侵染THP1细胞,实时荧光定量PCR检测NLRP3、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase1)及has-miR-5196-3p mRNA的表达情况,Western blotting检测NLRP3和caspase1蛋白表达水平;将has-miR-5196-3p mimics、has-miR-5196-3p inhibitor及阴性对照转染至THP1细胞,实时荧光定量PCR及Western blotting检测NLRP3和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase1)的表达水平。结果显示,试验成功构建含有NLRP3-3′UTR的野生型及突变型双荧光素酶报告载体;has-miR-5196-3p mimics极显著降低pmirGLO-NLRP3-3′UTR-wt的相对荧光素酶活性(P<0.01);布鲁氏菌侵染THP1细胞后,NLRP3炎症小体被激活,而has-miR-5196-3p无明显变化(P>0.05);has-miR-5196-3p mimics能显著抑制NLRP3的表达(P<0.05),而has-miR-5196-3p inhibitor则相反。结果表明,miRNA分子has-miR-5196-3p可与NLRP3-3′UTR结合并抑制其表达,布鲁氏菌侵染THP1细胞过程中通过has-miR-5196-3p靶向负调节NLRP3炎症小体的表达及炎症的发生。

has-miR-100-5p靶向含7A的锌指和BTB结构域是绝经后骨质疏松的潜在靶标

背景:miRNAs在骨质疏松症的发病机制中起重要作用,因此可以成为重要的治疗靶点。其中,靶向miR-100-5p调控轴促进成骨细胞分化是骨质疏松的潜在治疗靶标。目的:探讨has-miR-100-5p和has-miR-101-3p在绝经后骨质疏松中的靶向调控作用。方法:比较GSE56814和GSE56815数据中高骨矿物质密度和低骨矿物质密度之间的差异表达基因,并进行富集分析。预测差异表达基因中has-miR-100-5p和has-miR-101-3p的靶向调控的基因。随后,收集40例绝经后骨质疏松患者和40例健康对照者的外周血样本,采用qRT-PCR法检测has-miR-100-5p和has-miR-101-3p以及靶标基因的差异表达。最后,通过双荧光素酶报告基因检测has-miR-100-5p对靶标基因3’UTR的结合作用。结果与结论:①富集分析显示,高骨矿物质密度和低骨矿物质密度之间鉴定到81个共同差异表达基因,显著富集于免疫、核因子κB复合物、肿瘤坏死因子信号通路等;②miRTargetbase数据库和miRTarget数据库预测显示,has-miR-100-5p和has-miR-101-3p均靶向调控含7A的锌指和BTB结构域(zinc finger and BTB domain containing,ZBTB7A);③qRT-PCR检测显示,与健康对照组比较,骨质疏松组has-miR-100-5p mRNA表达上调(P<0.001),has-miR-101-3p和ZBTB7A mRNA表达下调(P<0.001);双荧光素酶报告系统显示,野生型ZBTB7A-3’UTR共转染has-miR-100-5p后,293T细胞的荧光活性下调;④结果显示,has-miR-100-5p靶向ZBTB7A可能是绝经后骨质疏松症的潜在靶标。

has-miR-1-3p通过调控BDNF/TrkB信号通路抑制人滋养细胞增殖和侵袭

目的:探讨has-miR-1-3p对人滋养细胞HTR-8/SVneo增殖和侵袭的影响及其相关机制。方法:HTR-8/Svneo细胞分为两组,分别转染has-miR-1-3p模拟物作为实验组及无义miRNA为对照组,采用CCK8和Transwell实验分别检测对细胞增殖和侵袭能力的影响。通过在线分析网站预测has-miR-1-3p的靶基因,采用双荧光素酶报告实验和Western blot实验验证has-miR-1-3p对靶基因的调控。结果:与对照组相比,has-miR-1-3p模拟物显著降低了HTR-8/Svneo细胞增殖和侵袭能力;双荧光素酶报告实验和Western blot实验结果表明has-miR-1-3p能够靶向抑制BDNF的表达,抑制TrkB的磷酸化;上调BDNF可降低has-miR-1-3p对HTR-8/Svneo细胞增殖和侵袭能力的抑制。结论:has-miR-1-3p通过调控BDNF/TrkB信号通路抑制人滋养细胞增殖和侵袭。

以Has-miR-100-3p抑制剂慢病毒表达载体建立稳定感染A549细胞株

目的用Has-miR-100-3p抑制剂的慢病毒来建立稳定感染人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞株,为进一步研究miR-100在NSCLC细胞中的机制奠定基础。方法用has-miR-100-3p抑制剂的重组慢病毒液,以其最适浓度感染A549细胞,获得稳定感染慢病毒的A549细胞株。荧光显微镜观察细胞感染效率,实时定量聚合酶链锁反应(qRT-PCR)和流式细胞术(FCM)分别检测稳定感染慢病毒的A549细胞株中miR-100的表达量和细胞株中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。结果荧光显微镜下可见绿色荧光在细胞中表达。qRT-PCR检测结果显示,感染抑制剂的A549细胞中miR-100的表达量显著减少;流式细胞术检测感染组细胞中均有GFP的表达。结论获得了has-miR-100-3p抑制剂的慢病毒稳定感染的A549细胞株,该细胞株中内源性miR-100的表达下调。

长链非编码RNA LINC01116靶向调控has-miR-4693-3P参与胶质瘤进程

目的观察脑胶质瘤细胞中长链非编码RNA LINC01116表达变化及shRNA转染对其细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响,同时探究LINC01116可能参与的调节方式。方法取神经胶质瘤细胞系U251、U87MG、A172细胞及正常星形胶质细胞(NHA),采用Real TimePCR法检测LINC01116表达。随后胶质瘤细胞分别加入或不加入sh-RNA转染,CCK-8实验检测细胞增殖情况,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。生物信息学预测LINC01116可能的调节方式,并采用双荧光素酶报告基因验证RNALINC01116与has-miR-4693-3P的调控作用。结果LINC01116在胶质瘤细胞中高表达,其抑制细胞增殖、抑制细胞迁移和胶质瘤侵袭。CCK8实验显示,sh-LINC01116处理的胶质瘤细胞存活率显著低于未转染的(P<0.05)。细胞划痕实验显示,sh-LINC01116处理的U251细胞迁移能力明显低于对照组(P<0.01)。Transwell实验显示,sh-LINC01116处理的U251细胞穿膜细胞数明显低于对照组(P<0.01)。双荧光素酶报告基因结果显示LINC01116k可靶向调控has-miR-4693-3P。结论胶质瘤多种细胞中LINC01116表达升高,shRNA转染能明显抑制其增殖、侵袭、迁移能力,同时LINC01116可靶向调控has-miR-4693-3P参与胶质瘤的进程。

抑制microRNA-202-3p表达促进滑膜间充质干细胞软骨分化

目的:探究microRNA-202-3p(miR-202-3p)对滑膜间充质干细胞(SMSCs)软骨分化能力的影响。方法:从骨关节炎(OA)患者手术切除的滑膜组织标本中分离培养SMSCs,分别以Has-miR-202-3p inhibitor和Has-miR-202-3p inhibitor negative control(NC)转染第3代SMSCs,分别设为实验组和对照组,培养7 d内,检测两组细胞增殖曲线;培养21 d后,组织学观察两组成软骨能力;qRT-PCR检测两组成软骨分化后细胞的软骨特异性基因表达。结果:滑膜间充质干细胞从第3天开始进入快速增殖期,CCK-8实验和亚甲蓝染色显示实验组细胞增殖数量明显多于对照组;成软骨诱导21 d后,实验组软骨特异性基因Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖、Sox9基因表达水平显著高于对照组(P<0.05)。结论:抑制microRNA-202-3p表达可促进滑膜间充质干细胞增殖和向软骨细胞分化。

Has-miR-31-3p表达与K-ras基因野生型转移性结直肠癌患者抗EGFR治疗的无进展生存期有关

目前抗EGFR治疗只应用于KRAS野生型转移性结直肠患者，然在这些患者的获益率只有不到40％。因而寻找更多更精确的生物标志物用于筛选出最适宜的治疗患者显得尤为迫切。为此，多中心协作开展了一项研究，该研究目的是筛选出能预测KRAS野生型转移性结直肠患者抗EGFR治疗疗效的miRNAs。该研究分析了87例mCRC患者miRNA表达谱，这些患者均对化疗耐受而选用抗EGFR治疗。其中包括回顾性的33例新鲜冷冻组织标本、35例福尔马林固定石蜡包埋标本，以及19例前瞻性研究获得新鲜冻藏标本。之后对前瞻性研究中转移性结直肠癌抗EGFR治疗患者中19例新鲜冻存和26例福尔马林固定石蜡标本（共45例）进行独立验证。

hsa-miR-221-3p靶基因预测及生物信息学分析

目的对hsa-miR-221-3p进行系统的生物信息学分析,预测hsa-miR-221-3p的靶基因、基因功能及信号通路。方法利用UCSC和miRBase在线数据库对hsa-miR-221-3p进行基因定位、分析其序列保守性,然后利用miGator v3.0数据库分析hsa-miR-221-3p在人类不同疾病和组织器官中的表达情况,利用Target Scan、miRTarBase和miRDB数据库交叉预测hsa-miR-221-3p的靶基因,使用在线软件Venny2.1对上述3个数据集绘制维恩图推导得到交集靶基因,再将预测的靶基因利用DAVID数据库进行基因本体(GO)功能分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号转导通路富集分析,采用String11.0数据库构建交集靶基因编码的蛋白间相互作用(PPI)网络图,进行编码蛋白间相互作用分析。结果hsa-miR-221-3p基因成熟序列高度保守,在肺部组织中富集表达;hsa-miR-221-3p的34种关键靶基因存在细胞多个组分中,执行多种分子功能,参与多种生物过程;这些靶基因富集于癌症和PI3K-Akt信号通路,编码的蛋白间形成了复杂的网络图。结论hsa-miR-221-3p在多种肿瘤组织和细胞中异常表达,通过靶基因对多种癌症发挥致癌或抑癌作用,以致癌作用为主,其可作为肿瘤潜在的研究标记物和治疗靶标。