基因重组人HSP73抗体的制备及对肿瘤细胞在温热作用后HSP70表达的检测

目的 用基因工程方法表达、提纯人热休克类似蛋白 73(HSP73) ,制备抗体 ,检测吐温 80协同 41℃温热对肿瘤细胞HSP70表达的影响。方法 用人HSP73基因构建原核细胞表达载体 pETHSP73,在大肠杆菌BL2 1中用半乳糖苷 (IPTG)诱导表达 ,经电泳法和ATP亲和层析法提取HSP73并作检测。用提纯蛋白免疫新西兰兔 ,制备抗HSP70多克隆抗体 ,测定其活性 ,用此抗体作免疫组化法观察 41℃温热和吐温 80协同时BGC 82 3胃癌细胞及B16黑色素瘤细胞的热休克蛋白 70 (HSP70 )表达情况。结果 人基因重组构建的pETHSP73能很好地在大肠杆菌中表达出分子量为73kD的蛋白。两种提纯方法均能有效提取表达蛋白 ,用 3a3单抗作Westrnblot检测证明该蛋白具有人HSP70的抗原活性 ,所得蛋白氨基酸测定和N端测序的结果与有关报道一致。以此蛋白制成的抗体活性可达 1∶80 0 0以上。并可检测出吐温 80合并温热有明显抑制肿瘤细胞SHP70表达的作用。结论 2 .1kb的基因片段构建的高表达载体能很好表达人HSP73活性蛋白。该蛋白免疫新西兰兔所得多克隆抗体具有很高抗人和鼠HSP70活性。用该抗体免疫组化法检测表明吐温 80协同 41℃温热可明显抑制肿瘤细胞HSP70的表达和耐热性的产生。

甲胎蛋白异质体3、高尔基体蛋白73及热休克蛋白27在原发性肝癌中的诊断价值

目的探讨甲胎蛋白异质体3(AFP-L3)、高尔基体蛋白73(GP73)、热休克蛋白27(HSP27)在原发性肝癌患者中的诊断价值。方法收集98例患者血清,其中原发性肝癌36例,肝转移癌14例,胃癌20例,健康对照28例,采用电化学发光法检测AFP,采用酶联免疫吸附试剂盒检测各组血清中AFP-L3、HSP27、GP73的表达情况。结果 AFP、AFP-L3、GP73、HSP27在原发性肝癌组的表达情况明显高于肝转移癌组、胃癌组及健康对照组,明显差异有统计学意义(P<0.01)。通过受试者工作特征曲线(ROC)评价作图,AFP、AFP-L3、GP73及HSP27曲线下面积分别为:0.969、0.977、0.978、0.985。AFP-L3、GP73及HSP27与AFP的相关性为0.896、0.853、0.838(P<0.05);AFP、AFP-L3、GP73及HSP27与乙肝表面抗原的相关性为0.076、0.119、0.176、0.176(P>0.05)。结论 AFP-L3、HSP27、GP73均可以作为原发性肝癌的肿瘤标记物,与AFP相比,具有更高的诊断价值,它们与表面抗原的表达情况无关。

基因重组人HSC73在大肠杆菌中的表达和纯化

目的 用基因工程方法表达人的热休克类似蛋白 73 ( HSC73 )并提纯 HSC73蛋白 ,为研究该蛋白提供条件。方法 用人 HSC73基因构建原核细胞表达载体 p ETHSC73 ,在大肠杆菌 BL 2 1中用异丙基硫代 -β-D半乳糖苷 ( IPTG)诱导表达 ,ATP亲和层析法提取 HSC73。经 SDS-PAGE、3 .a.3抗体 Western blot作 ECL检测。结果 人HSC73基因构建的载体 p ETHSC73能很好地在大肠杆菌表达出分子量为 73 k D的蛋白 ,蛋白提取方法能有效提纯表达的蛋白 ,用 3 .a.3抗体作 Western blot检测证实该蛋白具有人 HSC73抗原特性。所得蛋白质氨基酸测定和 N端测序的结果与有关报道的一致。结论 人 2 .1kb的 HSC73基因片段构建的高表达载体能够很好表达人 HSC73 ,用 ATP亲和层析法可以有效提纯有活性的人

GP73和HSP90α在低浓度甲胎蛋白原发性肝癌诊断中的应用价值

目的探讨高尔基体蛋白73(GP73)和热休克蛋白90α(HSP90α)在低浓度甲胎蛋白(AFP)原发性肝癌(PHC)诊断中的应用价值。方法收集150例血清,其中AFP低浓度PHC患者50例,肝硬化患者30例,肝炎患者30例,健康对照者40例。采用ELISA方法检测各组人群血清GP73和HSP90α含量,比较各组间GP73和HSP90α水平。结果AFP低浓度PHC患者中,血清GP73和HSP90α含量以及阳性检出率高于肝硬化、肝炎、健康对照者,差异有统计学意义(P均<0.01)。有淋巴结转移和门脉侵犯的AFP低浓度PHC患者血清GP73和HSP90α含量高于无淋巴结转移和门脉侵犯的PHC患者,差异有统计学意义(P<0.05)。单独检测中血清GP73和HSP90α灵敏度分别为78.0%和84.0%,特异度分别为77.0%和95.0%,准确度分别为77.3%和91.3%。联合检测中GP73或HSP90α任一阳性诊断AFP低浓度PHC的灵敏度最高,达到94.0%。而GP73和HSP90α同时阳性诊断AFP低浓度PHC的特异度最高,达到96.0%。结论血清GP73和HSP90α单独用于诊断AFP低浓度PHC的灵敏度和特异度都较高,可用于辅助诊断AFP低浓度PHC。两者联合检测具有更高的灵敏度,可提高对AFP低浓度PHC诊断的准确率,具有较高的临床应用价值。

肝细胞癌早期诊断血清标志物研究进展

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是源于肝脏细胞的恶性肿瘤,其有着恶性程度高,早期诊断困难,临床预后差的特点。近年来,越来越多的研究发现血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)对于肝细胞癌诊断敏感性降低,早期诊断效能较差,因此,对于新型肝细胞癌血清肿瘤标志物的研究成为热点。例如甲胎蛋白异质体、热休克蛋白90、高尔基体蛋白73等的出现可能有效提高肝细胞癌的早期诊断率。本文就近年来对于肝细胞癌早期诊断血清标志物研究进展做一综述。

高尔基体蛋白73及去γ-羧基凝血酶原联合甲胎蛋白检测对肝癌的诊断价值

目的 探讨血清去γ-羧基凝血酶原（DCP）、高尔基体蛋白73（GP73）、热反应蛋白70（HSP70）水平对肝癌的诊断价值.方法 收集2013年1至7月桂林医学院附属医院肝癌患者35例、健康对照者35名.采用电化学发光法和酶联免疫吸附法定量检测各组血清DCP、GP73、HSP70和甲胎蛋白（A FP）水平.结果 健康对照组AFP、DCP、GP73水平分别为1.240（0.605 ～ 5.310） μg/L、104.606（0.000 ～4 138.770）pg/ml、30.770（16.343 ～ 87.453） ng/ml,肝癌组分别为13.780（1.140 ～8 487.000）μg/L、3 213.953（2.510 ～53 994.602） pg/ml、76.838（24.500 ～ 232.875） ng/ml,均明显高于健康对照组,差异有统计学意义（U=134.50、258.00、168.00,均P＜0.01）;2组血清均未能检测出HSP70.血清DCP、GP73用于肝癌诊断的ROC曲线下面积分别为0.789、0.863,以2 939.4 pg/ml、41.3 ng/ml作为DCP、GP73诊断肝癌的临界值,则DCP诊断肝癌的敏感度为54.3％,特异度为97.1％,GP73诊断肝癌的敏感度为85.7％,特异度为74.3％.本研究中以常规20 μg/L作为血清AFP诊断的临界值,其敏感度仅为45.7％,特异度为100％,准确度为72.9％.联合检测中,GP73/AFP诊断肝癌的敏感度为88.6％,特异度为74.3％,准确度为81.4％;GP73/DCP/AFP诊断肝癌的敏感度为91.4％,特异度为71.4％,准确度为81.4％.结论 GP73联合AFP或GP73、DCP联合AFP检测可提高肝癌早期诊断的敏感度及准确度,建议将GP73、DCP及AFP的联合检测应用于肝癌的早期血清学诊断.

血清GP73、HSP27联合AFP检测在HBV相关早期肝细胞癌诊断的价值

目的探讨高尔基蛋白73(GP73)、热休克蛋白27(HSP27)联合甲胎蛋白(AFP)检测在乙型肝炎相关性早期肝细胞癌诊断中的价值。方法选择50例HBV相关早期肝细胞癌患者、50例乙肝肝硬化患者和30名健康人,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测GP73、HSP27水平,电化学发光法检测AFP含量。实时荧光定量PCR方法测定肝癌患者的HBV-DNA水平。结果早期肝癌组患者血清GP73、HSP27、AFP水平分别为(266.37±98.41)ng/ml、(847.18±211.72)pg/ml、(368.56±65.32)ng/ml,明显高于肝硬化组[(60.23±32.30)ng/ml、(338.46±114.3)pg/ml、(26.22±8.58)ng/ml]、以及对照组[(23.32±11.08)ng/ml、(73.39±38.54)pg/ml、(7.15±3.32)ng/ml],差异有统计学意义(均P<0.01);早期肝癌组患者血清AFP、GP73、HSP27单项检测阳性率分别为75%、82%、74%,及AFP+GP73+HSP27联合检测的阳性率为86%,均明显高于肝硬化组(分别为48%、37.5%、18%、32%)及健康对照组(分别为3%、6%、0、0)(均P<0.01),其中AFP+GP73+HSP27联合检测阳性率最高(P<0.01);AFP、GP73及HSP27与HBV-DNA的相关性为0.076、0.119、0.176(P>0.05)。结论 GP73、HSP27与AFP联合检测可作为诊断肝细胞癌的重要指标,为早期发现及治疗提供依据,它们与HBVDNA情况无关。