神经干细胞过表达Hsp75降低Aβ介导的神经毒性

目的:应用腺病毒为载体在体外过表达热休克蛋白75(Hsp75),研究Hsp75蛋白过表达对神经干细胞在Aβ诱导神经毒性中的作用,并初步探讨其作用机制。方法:体外培养小鼠神经干细胞C17.2,实验分为对照组、Aβ处理组、腺病毒阴性感染组和腺病毒Hsp75过表达感染组。使用荧光显微镜观察腺病毒的感染情况并进行细胞免疫鉴定;倒置相差显微镜观察各组神经干细胞的形态;MTT法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测Hsp75和活化型caspase-3蛋白水平。结果:荧光显微镜观察和Western blot检测表明腺病毒成功感染神经干细胞并高效表达Hsp75蛋白。此外,腺病毒感染不会导致细胞形态改变及细胞分化,同时也不会影响细胞活力。与对照组比较,Aβ处理组及腺病毒阴性感染组细胞存活率显著降低(P<0.05),细胞凋亡率及活化型caspase-3蛋白水平显著增高(P<0.05);然而,Hsp75过表达能显著提高神经干细胞的存活率,减少细胞凋亡和降低活化型caspase-3蛋白水平(P<0.05)。结论:Hsp75过表达对Aβ诱导损伤的C17.2细胞具有明显保护作用,其机制可能是与抑制caspase-3途径依赖的细胞凋亡有关。

人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17.2神经干细胞的表达

目的构建HSP75基因重组腺病毒载体,观察HSP75蛋白在C17.2神经干细胞中的表达。方法采用PCR方法从含人HSP75基因质粒中扩增HSP75基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点区域,构建重组穿梭质粒p HBAd-MCM-HSP75-GFP,在LipofiterTM转染试剂的介导下与腺病毒辅助骨架质粒p HBAd-BHGloxΔE1,3 Cre共转染HEK293细胞,整合包装成重组腺病毒,TCID50法测定病毒滴度。使用荧光显微镜、流式细胞仪和Western blotting观察重组腺病毒在C17.2细胞中的感染情况及HSP75蛋白的表达水平。结果通过酶切鉴定、测序、PCR鉴定,HSP75基因已正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒整合包装成重组腺病毒;重组腺病毒滴度为1.0×1010PFU/ml;Western blotting检测,转染后的神经干细胞表达HSP75蛋白。结论 HSP75重组腺病毒载体成功构建,对C17.2神经干细胞具有较高的表达效力。

白藜芦醇通过上调Hsp75蛋白表达改善Aβ对C17.2细胞增殖的抑制作用

目的探讨白藜芦醇拮抗Aβ_(1-42)诱导的体外培养神经干细胞C17.2凋亡的可能机制。方法实验分组分别为:空白对照组、Aβ_(1-42)(10μmol·L^(-1))处理组、白藜芦醇干预组(白藜芦醇1,5,10,20μmol·L^(-1)+Aβ_(1-42)10μmol·L^(-1))。采用MTT法检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用Western blotting法分别检测热休克蛋白75(Hsp75)和活化型caspase-3蛋白的表达水平。结果与Aβ_(1-42)处理组相比,白藜芦醇预处理组呈剂量依赖性地显著提高神经干细胞的存活率(P<0.05)和凋亡率(P<0.05);同样地,显著上调C17.2细胞Hsp75蛋白的表达和降低其活化型caspase-3蛋白水平(P<0.05)。而单独使用白藜芦醇对正常C17.2细胞活性影响的差异无统计学意义(P>0.05)。结论白藜芦醇对Aβ_(1-42)诱导的C17.2细胞损伤具有明显保护作用,其作用机制可能与上调C17.2细胞Hsp75蛋白的表达水平和抑制caspase-3蛋白介导的凋亡途径从而降低细胞凋亡有关。