条斑紫菜HSP90基因的克隆与表达分析

为了研究HSP90在条斑紫菜胁迫耐受中的作用,克隆了条斑紫菜HSP90基因(命名为PyHSP90),采用定量RT-PCR研究了其表达规律。PyHSP90基因包含一个长2274nt的完整开放阅读框,编码757个氨基酸。PyHSP90蛋白定位于细胞质中,具有HSP90蛋白家族的特征序列和保守结构域,与多种生物的HSP90具有较高的序列一致性。在进化树上条斑紫菜等红藻的HSP90与隐藻的亲缘关系最近,与绿藻和陆生植物亲缘关系较远。低温和高温胁迫都能显著性地诱导条斑紫菜叶状体PyHSP90基因的表达,而且表达量与胁迫程度成正相关;低盐胁迫下PyHSP90基因表达上调;而失水胁迫下PyHSP90基因表达下调。

pH、氨氮胁迫对中国对虾HSP90基因表达的影响

研究了pH、氨氮胁迫对中国对虾Fenneropenaeus chinensis血细胞、肝胰腺、鳃和肌肉组织HSP90基因时空表达的影响.分别将中国对虾暴露于pH7.0、9.0的水体中148h和不同氨氮浓度的水体中96h,结果表明,pH（7.0,9.0）胁迫条件下中国对虾鳃、肌肉和血细胞HSP90基因表达均上调,肝胰腺HSP90基因表达对两种pH胁迫差异明显：pH7.0胁迫条件下,HSP90基因表达3h达峰值后明显降低;pH 9.0胁迫时,HSP90基因表达水平逐渐升高,整个胁迫过程中均显著高于对照组（P＜0.05）,说明中国对虾肝胰腺组织是高pH胁迫的响应器官.6mg/L氨氮浓度组鳃和肌肉组织HSP90基因表达水平24h达最高值,分别为对照组的5.46和1.55倍;各胁迫组肝胰腺和血细胞HSP90基因表达水平分别于6h和48h达到最高值,为对照组的1.33～2.08倍和2.20～5.45倍.肝胰腺组织对氨氮胁迫表现敏感,短时间内（6h）通过上调HSP90基因表达水平保护细胞;鳃组织HSP90基因表达波动范围最大,说明鳃组织需要更高表达量的HSP90保护细胞.当氨氮浓度持续48～96h维持在2～6mg/L,各组织HSP90基因表达水平显著降低.

真蛸热休克蛋白90基因(HSP90)的克隆及表达

为深入了解真蛸热应激响应机制,实验以真蛸的应激蛋白为研究对象,借助同源扩增和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得真蛸热休克蛋白90(HSP90)的cDNA全序列(2 709 bp),它包含119 bp的5'非编码区(untranslated regions,UTR)、454 bp的3'UTR和2 136 bp的开放阅读框(opening reading frame,ORF),ORF共编码711个氨基酸,推算其分子量为81.5 ku,理论等电点为5.09。同源分析显示,所推导的氨基酸序列高度保守,并且含有HSP90家族特有的5个保守信号序列区域。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在所有选取的组织中均有表达,肝组织中表达量最高。

脊尾白虾热休克蛋白HSP90基因的原核表达与鉴定

将脊尾白虾热休克蛋白90基因克隆到原核表达载体pET-30a中,经酶切验证和DNA测序鉴定后,将重组质粒转化表达宿主大肠杆菌Rosetta,优化温度、时间、IPTG和OD600表达条件进行诱导表达,收集菌液,进行SDS-PAGE和质谱检测,并用Quantity one软件分析蛋白表达水平。结果表明,成功构建了含脊尾白虾HSP90基因的重组表达载体pET-30a-HSP90,表达目的蛋白相对分子量为82.7kD,为HSP90蛋白。通过条件优化认为重组菌株Rosetta/pET-30a-HSP90的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时机和诱导时间分别为0.58h、7h。

进展期胃癌HSP90的表达及其临床意义

目的探讨热休克蛋白90(HSP90)在进展期胃癌组织中的表达情况,并分析其与胃癌侵袭、转移及预后的关系。方法采用免疫组化染色法检测157例进展期胃癌组织中HSP90的表达情况,并分析HSP90表达与胃癌临床病理特征及预后的关系。结果胃癌组织中HSP90高表达率为68.2%(107/157)。HSP90表达与肿瘤大小、肿瘤部位、浸润深度、淋巴结转移及临床分期有关(P<0.05),与MMP-9表达呈正相关(r=0.514,P<0.001)。157例进展期胃癌患者的中位无复发生存时间(RFS)为27.0个月,中位总生存时间(OS)为33.0个月;HSP90低表达患者的中位RFS和OS均为60.5个月,而HSP90高表达者分别为15.0个月和20.0个月(P均<0.001)。Cox多因素分析显示,HSP90表达为影响胃癌预后的独立因素(P<0.05)。结论 HSP90表达与进展期胃癌的侵袭转移相关,其高表达提示预后不良。

Hsp90抑制剂的研究进展

热激蛋白90(heat shock protein90,Hsp90)作为分子伴侣在调节细胞生长、分化、凋亡等方面发挥着重要的作用。Hsp90抑制剂能与Hsp90结合,使其功能丧失,造成细胞的多种生理活动缺陷,在Hsp90功能研究和癌症治疗方面具有潜在的价值。综述了不同来源的Hsp90抑制剂及其作用机制,同时对新型Hsp90抑制剂的来源进行了探讨。

磷脂与Hsp90相互作用的荧光和红外光谱

为研究磷脂酰胆碱(PC)与热休克蛋白90(Hsp90)的相互作用机制,分别采用荧光光谱和红外光谱法研究Hsp90内源荧光的变化和磷脂主要基团的变化。结果显示:PC对Hsp90内源荧光有较强的猝灭作用,PC对Hsp90的猝灭属于形成复合物产生的静态猝灭,结合位点数为0.92,结合的主要作用力为氢键和范德华力;Hsp90与PC的相互作用发生在磷脂极性头端和非极性侧链上,并使磷脂的结构发生改变。磷脂可以稳定地与Hsp90结合。

琥珀蚕热激蛋白基因Hsp90的克隆和高低温胁迫下的表达分析

热激蛋白(heat shock protein,HSP)是生物体应对不良环境胁迫的关键蛋白,HSP90是热激蛋白家族中的重要成员。琥珀蚕(Antheraea assamensis)是一种半驯养的经济昆虫,在生长过程中常受到高低温等不利环境条件的冲击。从琥珀蚕中克隆得到AaHsp90基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:MK1656641),该序列长2482 bp,包括126 bp的5′非编码区(5′UTR)和202 bp的3′非编码区(3′UTR),开放阅读框为2154 bp,编码717个氨基酸,预测蛋白质分子质量为824 kD,等电点为500。AaHSP90氨基酸序列含有HSP90家族的5个特征序列及C末端的胞质保守基序MEEVD,氨基酸序列同源比对结果表明其与天蚕和柞蚕的同源序列相似度分别达到981%和990%。实时荧光定量PCR结果表明,该基因mRNA在琥珀蚕卵、幼虫期各龄及5龄第4天不同组织中均有表达;相对于对照组,在高温胁迫条件下其表达量显著上调,低温刺激条件下其表达则受到抑制。研究表明AaHsp90基因在琥珀蚕对环境温度适应中起重要作用。

B型烟粉虱和温室白粉虱热激蛋白90基因(hsp90)的全长cDNA克隆与系统发育分析

B型烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)biotype B和温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum均为全球普遍发生的重要害虫。本研究以其他昆虫热激蛋白90基因(hsp90)保守区域设计兼并引物扩增两种粉虱hsp90中间片段,然后利用RACE技术获得全长cDNA。温室白粉虱hsp90全长cDNA的开放性阅读框2166bp,编码722个氨基酸;烟粉虱hsp90全长cDNA的开放性阅读框2160bp,编码720个氨基酸。两种粉虱HSP90的完整氨基酸序列相似性高达92.94%,并均具有定义HSP90家族签名序列的5个氨基酸保守区域和末尾基序"MEEVD"。通过real-time PCR技术,探测到两个基因在mRNA水平上皆能高温诱导表达。采用昆虫纲所有完整HSP90氨基酸序列进行Kimura双参数遗传距离分析并构建NJ进化树,结果显示hsp90在昆虫纲低级阶元水平和高级阶元水平系统进化上能得到一个较理想结果。本研究结果为B型烟粉虱和温室白粉虱抗逆适应性研究提供基础,并进一步验证保守的功能基因hsp90可以作为研究生物系统发育的手段之一。

HSP90α联合CA-724在胃癌诊断和疗效监测中的价值研究

目的探讨肿瘤标志物HSP90α、CA-724表达在胃癌诊断价值中的研究。方法选取2018年6月~2020年3月秦皇岛市第一医院肿瘤科收治的胃癌患者80例(胃癌组)和同期健康体检者73例(健康对照组),检测HSP90α、CA-724在胃癌患者及健康对照组中的表达差异,分别比较HSP90α、CA-724及两者联合在诊断胃癌中受试者工作特征曲线(ROC)曲线下面积,对比HSP90α、CA-724在胃癌患者化疗前后的表达水平与化疗疗效的相关性。结果HSP90α、CA-724在胃癌患者中较健康对照组中表达明显升高,差异有统计学意义(t=4.43,P<0.05);HSP90α、CA-724 ROC曲线下面积均小于两者联合诊断时ROC曲线下面积,差异有统计学意义(P<0.05);当血清HSP90α高于85.25 ng/ml、血清CA-724高于7.62 U/ml时,具有临床诊断意义。胃癌患者化疗后HSP90α、CA-724表达水平急剧下降,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论HSP90α对胃癌患者的诊断具有阳性价值,HSP90α联合CA-724在胃癌中的诊断效价高于HSP90α或CA-724诊断效价,HSP90α联合CA-724具有评估胃癌化疗疗效的作用。

HSP90和GRP78与非小细胞肺癌完全切除术后吉西他滨化疗预后的相关性研究

【目的】探讨热休克蛋白90（HSP90）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在ⅢANz期非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其与吉西他滨辅助化疗的相关性。【方法】免疫组化方法检测HSP90、GRP78在134例手术完全切除ⅢA—N2期NSCI．C中的表达，分析HSP90和GRP78的表达与临床、病理及患者预后的关系。【结果】ⅢAN2期NSCLC中HSP90和GRP78阳性表达率分别为64．9％和61．2％；HSP90和GRP78的表达与吉西他滨化疗明显相关，HSP90和（或）GRP78表达阴性者在含吉西他滨化疗组有更长的无瘤生存期（P〈0．05）和总生存期（P〈O．05）。【结论】HSP90表达阳性、组织病理分化低、全肺切除是影响ⅢA—N2期NSCLC预后的危险因子；HSP90和GRP78的表达与铂类化疗相关，表达均阴性者预后较好。

NSCLC组织中MMP-9、bcl-2及HSP90α表达及其临床意义

【目的】探讨非小细胞肺癌（NSCLC）组织中基质金属蛋白酶．9（MMP-9）、B淋巴细胞瘤_2基因（bcl-2）、热休克蛋白90α（HsP90d）的蛋白及其mRNA的表达情况及临床意义。【方法】收集62例NSCLC患者的病理组织标本作为观察组，并取其中30例患者癌旁正常肺组织（距肿瘤边缘〉3cm）作为对照组，测定两组MMP-9、bcl-2、HSP90仅蛋白及其mRNA表达水平及与临床病理特征的相关性。【结果】①观察组MMP。9mRNA、bcl-2mRNA、HSP90α mRNA蛋白表达水平及阳性率均高于对照组（P〈0．05）；②不同TNM分期、伴或不伴淋巴结转移NSCLC患者组织MMP-9、HSP90ct蛋白阳性率比较差异有显著性（P〈0．05），不同组织类型NSCLC患者组织bcl-2蛋白阳性率比较差异有显著性（P〈0．05）。【结论】NSCLC组织中MMP-9、bcl-2、HSP900t蛋白阳性率均高于癌旁正常组织，MMP-9、bcl-2表达与TNM分期及淋巴结转移有关，bcl-2蛋白表达与NSCLC组织学类型有关。

Hsp90抑制剂对未折叠蛋白反应作用的研究进展

肿瘤细胞因癌基因突变、缺氧及营养受限而高度依赖未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。细胞通过内质网(endoplasmic reticulum,ER)膜上3个跨膜蛋白感知未折叠蛋白信号,引起未折叠蛋白反应,动态调控内质网折叠能力,一方面通过暂时减缓翻译和加快蛋白质流出减少ER蛋白质折叠负担,另一方面通过转录因子提高伴侣分子合成,增加ER折叠能力。未折叠的蛋白质长时间积聚在ER会对细胞产生毒性,引起不能缓解的ER应激状态,启动细胞凋亡程序。热休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)是一种进化保守的伴侣分子,参与了300多种新生蛋白质的折叠与成熟,其中包括UPR重要信号IRE1α(inositol-requiring enzyme 1α)。Hsp90抑制剂导致细胞产生大量未折叠蛋白质,同时直接诱导IRE1α的降解,从而破坏UPR恢复蛋白质平衡的能力,诱导UPR相关凋亡。目前,Hsp90抑制剂可有效诱导分泌型肿瘤细胞如骨髓瘤以及RAS突变肿瘤UPR途径的凋亡。

eNOS和HSP90在门静脉高压大鼠内脏高动力循环中的作用

目的通过门静脉部分结扎建立门静脉高压症大鼠模型,检测大鼠肠系膜动脉内皮一氧化氮合酶(e NOS)、热休克蛋白90(Hsp90)的表达,探讨二者在门静脉高压大鼠内脏高动力循环中的作用。方法检测假手术组(SHAM组)和门静脉高压症组(PHG组)大鼠肠系膜动脉中e NOS、Hs P90的表达。结果 e NOS、Hs P90在门静脉高压症组(PHG组)的表达比假手术组(SHAM组)显著升高。结论 e NOS和Hsp90S在门静脉高压症高动力循环中发挥重要作用。

黑麦热激蛋白ScHsp90-1基因的克隆及表达分析

本研究从黑麦中克隆了一个热激蛋白Hsp90基因,暂命名为ScHsp90-1,并对其序列进行分析。结果显示,该基因cDNA序列全长2 103 bp,共计编码700个氨基酸,蛋白质分子量约80.47 k D。序列同源性分析表明,ScHsp90-1与小麦、玉米、水稻等物种的热激蛋白同源性较高;进化树分析表明ScHsp90-1与小麦的Ta Hsp90亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR技术对其表达特性分析表明,ScHsp90-1对高温、低温、高盐、干旱等非生物胁迫均有响应,其可能是黑麦的一个胁迫相关基因。

Hsp90在胰腺癌组织中表达升高及其临床病理意义

目的分析热休克蛋白90(Hsp90)在胰腺癌组织中的表达水平与肿瘤发生、发展和转移的关系及其对预后的影响。方法用市售组织芯片,通过免疫组化法测定2009年1月至2013年8月期间病理确诊为胰腺癌的63例患者癌标本和癌旁组织中的Hsp90表达,用ANOVA或者t检验分析Hsp90表达水平与患者相关临床病理指标之间的关系。结果胰腺癌组织中Hsp90的表达量显著高于癌旁组织,与肿瘤的病理分级、淋巴结转移、临床分期、TNM分期有关(P<0.05)。结论胰腺癌组织中高表达Hsp90与胰腺癌的高侵袭、高转移能力密切相关,高表达的Hsp90可能作为胰腺癌的预后指标以提示患者预后差。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228通过阻断Hsp90功能杀伤乳腺癌MCF-7细胞

背景与目的:雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)与乳腺癌发生,发展及耐药密切相关,促进ERα降解可能成为解决乳腺癌耐药的一种新策略。本研究旨在观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylaseinhibitor,HDACi)FK228对乳腺癌MCF-7细胞系ERα的清除作用,并对其抗肿瘤作用机制进行深入研究。方法:MTT比色法测定FK228对MCF-7细胞杀伤的剂量-时间-效应关系;流式细胞仪分析细胞周期的改变;蛋白印迹及免疫共沉淀实验检测细胞内蛋白表达水平及翻译后修饰的变化。结果:FK228呈时间依赖性杀伤MCF-7细胞,阻断细胞周期于G2/M期,增强Hsp90乙酰化修饰,清除ERα及其他Hsp90底物蛋白,阻断Ras/Raf/MEK/ERK及PI3K/Akt信号通路,诱导细胞凋亡。结论:FK228通过乙酰化修饰影响Hsp90分子伴侣功能,介导ERα及其他Hsp90底物蛋白降解是其有效杀伤乳腺癌细胞的分子机制。FK228有可能成为乳腺癌治疗的新型药物。

多肽P7对肿瘤组织的靶向识别与Hsp90表达水平相关

目的分析热休克蛋白90(Hsp90)双功能靶向抑制多肽LPLTPLP(P7)对不同肿瘤组织及癌旁组织的识别效果,以及与Hsp90表达的相关性。方法通过免疫组化和免疫荧光染色法分别检测组织芯片中48例16种器官肿瘤及匹配或不匹配的边缘或癌旁组织的Hsp90表达水平以及FITC-P7的识别效果,并对两组数据进行相关性分析。结果在肿瘤组织中,Hsp90高表达且对FITC-P7的识别效果更好,两组数据呈现中度相关性(r=0.5147,P<0.01)。结论P7对肿瘤组织的识别与其Hsp90表达水平相关,证实了P7靶向Hsp90的能力。

HSP90通过PTK2B影响Aβ_(1-42)诱导的痴呆小鼠学习记忆功能

目的:探讨热休克蛋白90(HSP90)和蛋白酪氨酸激酶2β(PTK2B)与Aβ_(1-42)诱导痴呆模型小鼠学习记忆功能的关系。方法:32只C57BL/6J小鼠分为对照组(NS)、痴呆模型组(Aβ_(1-42)+NS)、HSP90抑制剂Luminespib处理组(Aβ_(1-42)+Lum)以及PTK2B抑制剂PF431396处理组(Aβ_(1-42)+PF)。实验组侧脑室注射Aβ_(1-42)构建痴呆模型后分别注射HSP90抑制剂或PTK2B抑制剂进行处理。采用水迷宫对小鼠学习记忆功能进行检测,Western Blot检测海马HSP90、PTK2B的表达情况以及tau蛋白磷酸化水平(p-tau),免疫组织化学染色检测海马HSP90和PTK2B的表达,real time RT-PCR检测PTK2B mRNA表达。结果:在Aβ_(1-42)诱导的痴呆模型小鼠海马中,PTK2B及p-tau水平均升高,HSP90水平降低(P<0.01)。而应用HSP90抑制剂则更进一步导致小鼠海马PTK2B、PTK2B mRNA及p-tau的水平升高(P<0.05),并使小鼠学习记忆功能减退;抑制PTK2B后小鼠海马中tau磷酸化水平降低(P<0.01),且小鼠学习记忆功能得到改善,但HSP90表达水平无明显变化(P>0.05)。结论:Aβ_(1-42)诱导的痴呆模型小鼠海马组织中HSP90降低,PTK2B升高。抑制HSP90可能通过促使PTK2B表达和tau蛋白磷酸化水平上升使小鼠学习记忆功能减退。

子痫前期患者血清PCT,HSP90及hs-CRP检测的临床意义

目的通过检测子痫前期(preeclampsia,PE)患者血清中降钙素原(procalcitonin,PCT)、热休克蛋白90(heat shock protein,HSP90)和超敏C反应蛋白(highsensitivity C-reactive protein,hs-CRP),评价它们在子痫前期诊断中的临床价值。方法将65例子痫前期孕妇分为轻度子痫前期组(轻度组)和重度子痫前期组(重度组),另选择同期34例健康孕妇作为对照组。各组受试者均检测血清PCT,HSP90及hs-CRP水平,分析其与子痫前期及其严重程度的相关性。结果 (1)轻度组、重度组、对照组血清PCT表达水平分别为0.22±0.05,0.88±0.13和0.04±0.02ng/ml,各组之间差异具有统计学意义(F=9.73,P<0.01),与对照组相比,重度组(q=7.36,P<0.01)、轻度组(q=5.27,P<0.01),差异均具有统计学意义。(2)轻度组、重度组、对照组血清HSP90表达水平分别为1.10±0.16,2.7±0.26和0.38±0.15ng/ml,各组之间差异具有统计学意义(F=8.52,P<0.01),与对照组相比,重度组(q=6.34,P<0.01)、轻度组(q=4.48,P<0.01),差异均具有统计学意义。(3)轻度组、重度组、对照组血清hs-CRP表达水平分别为17.50±2.90,63.00±12.20和3.90±0.90mg/L,各组之间差异具有统计学意义(F=11.59,P<0.01),与对照组相比,重度组(q=9.37,P<0.01)、轻度组(q=5.46,P<0.01),差异均具有统计学意义。(4)子痫前期组血清中PCT,HSP90及hs-CRP表达水平与其疾病严重程度正相关(r值分别为0.871,0.874,0.931,均P<0.01)。结论血清PCT,HSP90及hs-CRP与子痫前期的发生及疾病严重程度高度相关,可用于子痫前期的预测、诊断及疾病严重程度的评估。