大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ基因核苷酸序列分析与免疫原性研究

对构建的重组质粒ｐＸＳＴ１（含有耐热性肠毒素ＳＴ１和ＬａｃＺ基因）进行核苷酸序列分析的结果表明，该质粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫学试验结果表明，构建的ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）重组菌株安全无毒。该重组菌株表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，且抗体能中和天然肠毒素ＳＴ１活性，具有较好的免疫保护作用。由此表明。

表达大肠杆菌肠毒素ST_1—LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴ－ＳＬＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＬＤ１００的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ，ＳＴ＋，ＬＴ＋）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ＳＴ１的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。

表达大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴ－ＳＬＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＬＤ１００的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ，ＳＴ＋，ＬＴ＋）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ＳＴ１的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。

大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合基因表达条件的优化

目的:对已构建的含有大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的重组菌株进行鉴定和表达条件优化。方法:采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下ST1-LTB融合基因的表达情况。结果:酶切鉴定证实重组质粒pXSL1含有ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,以IPTG为诱导剂诱导ST1-LTB融合基因表达的优化条件是:培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时ST1-LTB融合蛋白表达量达35.2%。结论:实现ST1-LTB融合基因的高效表达,为大肠杆菌肠毒素双价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的实验数据。

大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B三价基因工程菌株的构建

利用 PCR技术 ,从大肠杆菌 C8390 2质粒中扩增出 K88ac基因、ST1 突变基因和 L TB基因 ,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化 ,构建了含 K88ac- ST1 - L TB融合基因表达载体的重组菌株 BL 2 1 (DE3) (p XKST3L T5 )。经酶切鉴定和 DNA序列分析证实 ,构建的重组质粒 p XKST3L T5中含有 K88ac- ST1 - L TB融合基因 ,且基因序列和阅读框架均正确。免疫试验结果表明 ,K88ac- ST1 - L TB融合蛋白能够诱发机体产生抗体 ,该抗体具有中和天然 ST1 肠毒素毒性的作用。用从 IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠 ,结果免疫小鼠至少能抵抗2 ML D的大肠杆菌强毒株 C8390 2 (K88ac,ST+ ,L T+ )的攻击。由此表明 ,构建的工程菌株 BL 2 1 (DE3) (p XKST3L T5 )