幽门螺杆菌尿素膜通道基因的克隆和表达

目的克隆幽门螺杆菌(Hp)尿素膜通道基因(ureI)和构建能表达UreI蛋白的原核表达工程菌,并初步研究产物的表达特性和免疫特性。方法用PCR方法从Hp基因组中克隆ureI基因,构建原核表达重组质粒pET32a/ureI,双酶切和测序鉴定正确后,重组质粒转染大肠杆菌BL21+(DE3),构建高效表达UreI的工程菌BL21+/UreI。不同温度条件下用1.0mmol/LIPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Gel-ProAnalyzer4分析重组蛋白的表达,并用Westernblotting对其免疫原性进行分析。结果克隆到约650bp的基因片段,测序结果与GENBANK中对应菌株的ureI序列100%同源,与其他Hp的序列同源性不低于98.5%。工程菌BL21+/UreI含完整的ureI基因。在37℃、1.0mmol/LIPTG诱导14h后,重组蛋白表达量可达菌体总蛋白的20.2%。分析表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,经免疫印迹证实该重组蛋白有一定的免疫反应性和特异性。结论成功构建了HpureI基因的原核表达载体,该载体可高表达有免疫特性的重组蛋白,为进一步研究Hp在胃的定植机制和抗Hp新药奠定了基础。

幽门螺杆菌过氧化氢酶的重组表达、纯化及免疫特性研究

目的 对幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp）的过氧化氢酶（catalase,KatA）进行重组表达和纯化,并进行免疫学特性研究.方法 采用PCR扩增幽门螺杆菌katA全长基因,构建重组表达载体pET-28a-katA,在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达,通过包涵体洗涤和亲和层析纯化出重组蛋白,并采用Western blot和ELISA等方法对其进行免疫学特性研究.结果 克隆出幽门螺杆菌1 518 bp的全长katA基因,在大肠埃希菌中诱导表达出505个氨基酸组成、分子量约为58 000的重组KatA蛋白,其表达量约占细菌总蛋白的20%,且以包涵体形式表达.经亲和层析的重组蛋白纯度约为85%,并可与兔抗Hp抗血清发生特异性反应.通过重组蛋白的动物免疫可产生高效价抗血清,并特异性识别多种Hp菌株.结论 成功重组表达与纯化出幽门螺杆菌KatA蛋白,并具备良好的免疫学特性,为Hp致病机制、血清学诊断以及亚单位疫苗研究奠定重要的实验基础.