Cd对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)主要组织器官SOD和POD同工酶的影响

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的方法,研究了5种浓度的镉(Cd:7.25,14.5,29,58,116mg/L)对河南华溪蟹(Sinopotamonhenanense)肝胰腺、鳃和心脏中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)同工酶的影响。结果显示,在实验剂量范围内,随着Cd浓度的增加,肝胰腺和鳃中SOD同工酶和POD同工酶有显著的变化,包括新酶带的出现和酶带强度的变化.Cd对肝胰腺和鳃中SOD同工酶具有明显的激活效应,但是对POD同工酶却有抑制作用.Cd对心脏中SOD同工酶的影响不明显,基本没有变化,但却可以抑制POD同工酶的相对活性,包括酶带数和酶带强度的变化.表明SOD和POD同工酶的变化可以灵敏地反映Cd对河南华溪蟹的胁迫程度及毒性大小.

灵宝杜鹃SBP基因家族鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析

【目的】SQUAMOSA启动子结合蛋白(SBP)家族在植物发育和非生物胁迫等方面起重要作用,该研究可为灵宝杜鹃SBP基因家族成员的生物学功能和在非生物胁迫响应的调控功能提供参考,并为灵宝杜鹃物种保护奠定基础。【方法】用生物信息学方法对灵宝杜鹃(Rhododendron henanense subsp.lingbaoense)SBP基因家族成员进行全基因组鉴定和分析,基于转录组数据分析组织特异性,并用qRT-PCR方法检测SBP在非生物胁迫下的表达。【结果】(1)从灵宝杜鹃基因组中共鉴定出19个含SBP保守结构域SBP成员,依次命名为RhlSBP1-RhlSBP19,基因不均匀分布在8条染色体上,编码的氨基酸长度为179~1072 aa,分子质量为20.26~118.73 kD;蛋白定位于细胞核;(2)系统发育分析将19个RhlSBP分为5个亚族,大部分RhlSBP与拟南芥AtSPL家族成员聚类;(3)所有的RhlSBP共有motif 1、motif 2和motif 4,基因结构显示Ⅳ、Ⅴ亚族内含子数量远多于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚族;(4)RhlSBP启动子中含有大量光响应元件、激素响应元件和环境胁迫响应元件,推测RhlSBP可能在灵宝杜鹃响应光调控、环境胁迫中发挥重要作用;(5)灵宝杜鹃与其同科植物羊踟蹰、圆叶杜鹃的SBP基因有更高的共线性;(6)RhlSBP基因亚家族成员具有相似的组织表达模式;(7)RhlSBP基因对非生物胁迫具有响应作用,但不同成员在不同胁迫下的响应程度存在差异。茉莉酸甲酯和低温处理后,基因表达总体呈上调趋势,高盐会抑制RhlSBP基因表达,干旱条件下,RhlSBP基因表达呈先上调再下调趋势。【结论】RhlSBP1、RhlSBP8可能是干旱、低温和MeJA诱导关键基因。

灵宝杜鹃bZIP家族全基因组鉴定及表达特征分析

【目的】鉴定灵宝杜鹃(Rhododendron henanense subsp.lngbaoense)基因组的碱性亮氨酸拉链转录因子(basic leucine zipper,bZIP)家族成员,研究其非生物胁迫下的表达模式。【方法】鉴定RhlbZIP家族成员,构建系统发育树,进行基因结构、保守基序、顺势作用元件和表达模式分析。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,分析RhlbZIP基因在非生物胁迫中的表达。【结果】共鉴定出57个RhlbZIP基因,划分为11个亚家族,同一亚族成员有相似的结构和基序;不均匀地分布在13条染色体中,共线性分析发现共发生45次复制事件(3对串联复制,42对片段复制);顺式作用元件分析表明,RhlbZIP家族成员可能响应转录、发育、激素调控、生物与非生物胁迫等生物学过程;GO注释分析表明,RhlbZIP基因家族与转录调节、代谢、生物学过程等相关。转录组结果显示,87.72%的WRKY家族基因在根、茎、叶、花和下胚轴5种组织中均表达,但表达水平存在明显差异。RT-qPCR表达模式表明,RhlbZIP4低温处理下显著上调表达;RhlbZIP24在干旱和ABA处理下显著上调;RhlbZIP16在高盐和MeJA处理下显著上调。【结论】灵宝杜鹃基因组中共鉴定出57个RhlbZIP基因,所选的基因在不同处理下均有表达,其中低温、干旱、高盐、ABA与MeJA胁迫处理中的主效基因分别是RhlbZIP4、RhlbZIP24、RhlbZIP16、RhlbZIP24与RhlbZIP16。

镉诱导华溪蟹不同组织金属硫蛋白表达及镉蓄积的研究

为了系统研究镉诱导华溪蟹不同组织(肝胰腺,腮)金属硫蛋白(MT)表达及镉蓄积状况,并探讨二者之间的关系,采用体外镉暴露法处理华溪蟹,用镉-血红蛋白饱和法和火焰原子吸收分光光度法(AAS)分别测定华溪蟹肝胰腺及腮中镉蓄积及MT表达含量.结果显示,暴露期间动物死亡率低于9.2%,体重未见显著变化.不同浓度镉暴露下,华溪蟹体内镉蓄积及金属硫蛋白表达具有明显组织差异,且呈现一定的时间-效应与剂量-效应关系.鳃中镉蓄积量高于肝胰腺且最高达到(15.41±3.21)μg·g-1;而肝胰腺中MT表达量高于鳃,最高达到(97.18±11.83)μg·g-1.通过鳃及肝胰腺中MT的镉结合率计算,显示肝胰腺中的镉可完全被MT结合,而鳃中镉蓄积量远远大于MT结合能力.

镉诱导金属硫蛋白在华溪蟹组织中的表达

采用体外暴露染毒法,研究了不同浓度与时间条件下,镉诱导河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)金属硫蛋白(metallothionein,MT)在肝胰腺、肌肉、鳃和卵巢中的表达差异。镉浓度分别为0、14·5mg/L、29mg/L和58mg/L;处理时间依次为1d、3d和5d。利用镉血红蛋白饱和法和火焰原子吸收分光光度法(AAS)测定MT的蛋白含量。结果显示,用不同的染毒浓度和处理时间,镉在组织中诱导产生MT的含量有较大差异,其中肝胰腺MT的诱导量最大,变化规律也最明显;肌肉中也有较大量MT的表达;而鳃和卵巢MT的诱导量均较低。此外,本文分析了镉的浓度与时间梯度对诱导MT表达的影响与毒性效应机制。结论:组织不同,染毒浓度及时间不同,镉诱导MT的表达也不同,具有一定的组织差异性和规律性。

霍山石斛与河南石斛生药学特征比较研究

在植物分类学方法鉴定的基础上,对霍山石斛及其主要伪品河南石斛药材的性状特征,根、茎、叶横切面显微特征,粉末显微特征和粉末中细胞内含物进行了研究,明确了霍山石斛药用部位的性状特征及显微特征,为霍山石斛药材和饮片的真伪鉴别提供参考依据,为该药材的进一步研究、开发、利用及质量标准的构建提供理论依据。

河南华溪蟹消化系统的形态结构观察和组织学研究

为研究河南华溪蟹消化系统的形态结构及组织学特征,采用石蜡切片、H.E.染色和光镜等技术,对河南华溪蟹成蟹消化系统各组织器官的结构进行了观察。结果显示,河南华溪蟹的消化系统主要由消化道和消化腺组成。消化道主要包括食道、胃、中肠和后肠,消化腺为肝胰腺。胃包括贲门胃和幽门胃:贲门胃内有钙化的几丁质齿、隆嵴、短刺及刚毛等组成的胃磨,可磨碎食物;幽门胃内侧可见特殊形态的梳状结构,可过滤食物。在光学显微镜下,食道、中肠和后肠均由黏膜层、肌层和结缔组织层构成,其各段内表面均有由上皮细胞与基膜内凸形成的多级皱褶和嵴,有由环形、纵形和辐射状排列的肌层。仅中肠表面有典型微绒毛结构,无角质膜。食道与后肠上皮表面均有较发达的纤毛层。肝胰腺主要由基膜和4种上皮细胞构成,即吸收细胞(R细胞)、泡状细胞(B细胞)、纤维细胞(F细胞)和胚细胞(E细胞)。

铜·镉·铬·铅对河南华溪蟹的急性毒性作用

[目的]为水产品的健康养殖提供科学依据。[方法]以对环境因子敏感的指示生物河南华溪蟹为材料,研究了Cu、Cd、Cr、Pb对河南华溪蟹的急性毒性作用。[结果]在同一时间,河南华溪蟹的死亡数随重金属浓度的升高呈"S"型增长。处理组中河南华溪蟹溪蟹的死亡数和死亡率均随重金属浓度的升高和处理时间的延长而增加。4种重金属对河南华溪蟹的半致死剂量(LC50)随处理时间的延长而减小。4种重金属在24h对河南华溪蟹的毒性依次为Cu>Cr>Cd>Pb,而48h毒性依次为Cd>Cu>Cr>Pb。与其他3种重金属相比,Cd的半致死浓度随时间的延长而较为显著地下降。[结论]河南华溪蟹对重金属具有较强的耐受力。

便携式近红外光谱仪快速无损鉴别霍山石斛枫斗和河南石斛枫斗

采用便携式近红外光谱仪采集231个霍山石斛枫斗和河南石斛枫斗样品的近红外光谱,采用一阶导数(1st D)、标准正态变量变换(SNV)、均值中心化(MNCN)、多元散射校正(MSC)、矢量归一化(N)等方法及其组合的9种方法预处理原始光谱,应用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)建立快速无损鉴别霍山石斛枫斗和河南石斛枫斗的数据模型,比较不同光谱预处理方法对PLS-DA建立模型的准确率影响,以预测模型的正确率、敏感性、特异性为指标,评价模型的优劣。结果表明:1st D+SNV+MNCN预处理方法的效果最好,模型的准确率最高,在潜在变量是12的情况下,校正集、交互验证集、预测集的准确率都为100%;模型的敏感性、特异性都为100%。

组培霍山石斛、野生霍山石斛及河南石斛多糖及乙醇溶出物动态积累规律研究

为了揭示不同种源的霍山石斛及其近缘种河南石斛多糖和醇溶性浸出物含量的动态变化规律,为霍山石斛和河南石斛规范化种植及品种鉴定提供依据,采用蒽酮-浓硫酸比色法和醇溶性浸出物热浸法对1~4年株龄的野生霍山石斛、组培霍山石斛和河南石斛的多糖和浸出物含量进行测定。结果表明,不同株龄的组培霍山石斛、野生霍山石斛和河南石斛的多糖、浸出物含量均存在极显著差异。以多糖含量为标准,三者均以生长2年采收为宜,以醇溶物为标准,以栽培三年采收最好。以多糖和醇溶出物总量计,组培霍山石斛以2年采收为宜,野生霍山石斛及河南石斛以3年株龄品质最佳。

铜诱导华溪蟹金属硫蛋白的分离纯化

采用体外铜暴露法对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)进行处理,诱导金属硫蛋白(metallothionein,MT)的高效表达。取肝胰腺组织匀浆、冷冻离心,采用丙酮沉淀粗提(50%～80%),然后将MT粗提液依次经过Sephadex G-50凝胶过滤层析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、透析脱盐、冷冻干燥,分离纯化MT,并进行洗脱峰的紫外光谱扫描分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)及质谱分析。结果表明:得到了纯度较高的华溪蟹MT,主要以单体及二聚体形式存在,其分子量为6882D。

河南纺蚋多线染色体研究

目的对河南纺蚋多线染色体核型及带型进行描述,对稳定且可作为该种重要鉴别依据的结构特征加以识别,并提供表示多线染色体相对长度、着丝粒位置和重要界标的模式图。方法取成熟幼虫分离出唾液腺,经苯酚品红染色、压片后,镜检、摄影和测量,作统计学处理。结果与结论河南纺蚋多线染色体数目为3条,第Ⅰ号具中央着丝粒,第Ⅱ、Ⅲ号为亚中央着丝粒,臂比值(着丝粒位置)高度稳定;ⅠS、ⅠL、ⅡS、ⅡL、ⅢS游离端均钝圆深染,ⅢL末端疏松膨大为扇形呈颗粒状浅染;核仁组织原、巴氏环、双泡、宽深带以及浅染膨大区等主要特征性结构的位置及形态恒定一致,可作为该种的重要鉴别特征。

脂多糖对镉致河南华溪蟹免疫因子毒性的调节作用

目的:探讨免疫刺激剂脂多糖对镉处理后的河南华溪蟹是否有调节作用,以及脂多糖的作用机理。方法:设置5个脂多糖处理组(0.5、1.0、2.0、4.0和8.0μg/m L)和1个对照组(无菌生理盐水),分别刺激溪蟹12、24和48 h后,根据机体中血淋巴细胞总数和溶菌酶活力的变化,选取脂多糖最佳作用条件;镉暴露溪蟹96 h后,按最佳作用条件注射脂多糖(8.0μg/m L,24 h),测定血清中溶菌酶和酸性磷酸酶活力。结果:脂多糖刺激溪蟹后,血细胞数量和溶菌酶活力的变化表现出时间-剂量效应;镉暴露后注射脂多糖,溪蟹血清中溶菌酶活力无显著变化,而酸性磷酸酶活力与镉单独作用组相比显著升高。结论:脂多糖对河南华溪蟹免疫系统有良好的刺激作用,该研究为探讨脂多糖对甲壳动物刺激作用机理提供了理论基础,同时也可为脂多糖作为免疫增强剂在水产养殖中的研究应用提供参考。

柱前衍生化HPCE法测定不同种源石斛中多糖的单糖组成

目的:采用PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)柱前衍生化-HPCE法测定多糖的单糖组成,探讨不同种源霍山石斛、铜皮石斛及野生河南石斛药效物质基础的相似性。方法:采用石英毛细管柱(100 cm×50μm),350mmol/L硼酸溶液(以1.0 mol/L Na OH溶液调至p H 10)为缓冲液,运行电压20 k V,柱温为25℃,检测波长250 nm,运行时间34 min。结果:5种石斛样品共检出木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和核糖6种单糖。相似度评价显示,同一种源石斛样品10个批次间的相似度均在0.98以上,但不同种源的霍山石斛、铜皮石斛及野生河南石斛单糖组成及含量明显不同。结论:多糖部位PMP柱前衍生化-HPCE法具有简单、快速、准确、重现性好等优点,为不同种源的霍山石斛、铜皮石斛与野生河南石斛的定性鉴别及药材内在质量评价提供新的参考依据。

河南华溪蟹金属硫蛋白的GST融合表达及工程菌吸附重金属的研究

目的:构建河南华溪蟹金属硫蛋白(MT)的GST融合表达系统,诱导其可溶性表达,并检测转MT工程菌吸附重金属的能力。方法:采用基因工程技术,将河南华溪蟹MT的cDNA克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达。在此基础上采用火焰原子吸收分光光度计测定工程菌对重金属离子Cu^(2+)、Cd^(2+)、Zn^(2+)的吸附能力。结果:pGEX-6p-1-MT重组质粒构建成功,SDS-PAGE分析表明GST-MT为可溶性表达,表达菌体对3种重金属的生物吸附能力均显著高于空菌体(P<0.01)。结论:实现了华溪蟹MT的GST融合表达,转MT工程菌对Cu^(2+)、Cd^(2+)、Zn^(2+)具有显著吸附作用,且对Cd^(2+)的吸附作用最强。

急性铅染毒对河南华溪蟹副性腺诱导精子顶体反应的影响

为探究河南华溪蟹副性腺的功能以及铅对副性腺功能的影响和毒性机理,首先采用钙离子载体A23187诱导法对河南华溪蟹进行精子顶体反应诱导实验,结果显示副性腺匀浆+A23187组合下的顶体反应诱导率最高,可达78%,这提示河南华溪蟹副性腺具有调节精子顶体反应的作用。在此基础上采用急性铅染毒的方法,设1个对照组和5个铅处理组(3.675、7.35、14.70、29.40和58.80 mg/L),染毒时间分别为3、5和7 d,检测了铅染毒后的副性腺对精子顶体反应诱导率的影响,以及染毒后副性腺中活性氧(ROS)含量、蛋白质羰基化(PCO)含量、DNA-蛋白质交联率(DPC)的变化。结果显示,随着铅染毒剂量的增加和染毒时间的延长,精子顶体反应诱导率明显下降,副性腺中ROS含量和PCO含量升高,但DPC无明显变化。研究表明,铅对河南华溪蟹副性腺有明显的生殖毒性,可降低其在精子顶体反应诱导过程中的作用,主要原因是铅诱导产生的ROS使副性腺中蛋白质发生了氧化损伤。

霍山石斛野生植株·组培植株与河南石斛叶表皮微形态特征研究

[目的]比较霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛的叶表皮微形态结构特征,为霍山石斛的真伪鉴定提供依据。[方法]在光学显微镜下,观察霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛的叶表皮微形态结构,并测定气孔器密度、分布及气孔指数等。[结果]3种石斛叶的上表皮细胞多为规则的六边形,霍山石斛野生植株、组培植株下表皮细胞为不规则形和近多边形,河南石斛的下表皮细胞为多边形,3种植物垂周壁式样相似;3种石斛叶的上表皮均无气孔,下表皮气孔无规则分布,霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛气孔长宽比分别为1.12、1.55、1.31,气孔器密度分别为109、156、94个/mm2,气孔指数分别为8.9%、12.5%、8.2%。[结论]霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛叶表皮细胞形状、气孔分布、垂周壁式样均比较相似,难以作为分类的依据。气孔器形状、密度、大小表现出比较稳定的差异,可以作为这3种石斛之间区分的依据。

霍山石斛、铁皮石斛与河南石斛花茶多级红外光谱快速鉴定研究

将石斛的鲜花干制成花茶,作为保健饮料日渐为市场接受。由于口感、药理活性与产量的差异,不同来源的石斛花茶,价格差异显著,其中以霍山石斛花茶价格最高。在经济利益驱使下,以价格较低的铁皮石斛、河南石斛花茶冒充霍山石斛花茶时有发生,急需构建霍山石斛花茶与铁皮石斛、河南石斛花茶的鉴定方法。建立一种快速鉴定霍山石斛、铁皮石斛、河南石斛花茶多级红外光谱方法。收集不同企业生产的不同批次的霍山石斛、铁皮石斛、河南石斛花茶样品,利用衰减全反射测定4 000~400 cm^-1范围内一维红外光谱;一维红外光谱通过数据变换获得二阶导数光谱;利用温度微扰获得二维红外光谱。分析一维红外光谱、二阶导数光谱、二维红外光谱获得三种石斛花茶区别。结果显示,三种石斛花茶的一维红外光谱非常相似,很难从外观上看出三者的区别。分析一维红外光谱吸收峰发现,霍山石斛花茶在1 398 cm^-1有特征峰,铁皮石斛花茶在1 542 cm^-1有特征峰,河南石斛花茶在1 610, 1 332,811, 703和603cm^-1等处有特征峰;二阶导数处理能明显的提高光谱分辨率、增加光谱灵敏度。三种石斛花茶在1 800~600cm^-1的二阶导数光谱上,可以观察到明显差异:在1 750~1 690 cm^-1区间,相对铁皮石斛与河南石斛,霍山石斛花茶二阶导数光谱呈明显"M"形;在1 140~1 080 cm^-1区间,霍山石斛与河南石斛二阶导数光谱呈"W"型,铁皮石斛呈不规则形;在1 000~930cm^-1区间,霍山石斛花茶二阶导数光谱为"M"形,铁皮石斛与河南石斛花茶呈"W"形;二维红外光谱显示,在1 230~1 130 cm^-1区间,霍山石斛有5个分别位于1 134, 1 155, 1 182, 1 196和1 211cm^-1的自动峰,铁皮石斛有2个分别位于1 186和1 210cm^-1的自动峰,河南石斛有3个自动峰,位于1 186, 1 197和1 209cm^-1。霍山石斛在1 230~1 130 cm^-1区间存在正相关峰(1 182和1 210cm^-1)、正相关峰(1 135和1 181cm^-1)、负相关峰(1 197, 1 155 cm^-1),而河南石斛和铁皮石斛在该区间没有明显的相关峰。根据一维、二阶导数和温度微扰二维红外光谱可以快速鉴别霍山石斛、铁皮石斛与河南石斛花茶。

河南华溪蟹金属硫蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备小鼠抗河南华溪蟹金属硫蛋白(MT)单克隆抗体(mAb),并鉴定其免疫学特性。方法分别利用小泛素样修饰蛋白(SUMO)融合表达系统和碱性磷酸酶(phoA)分泌表达载体制备河南华溪蟹重组蛋白SUMO-MT和His-MT,以SUMO-MT为免疫抗原、His-MT为检测抗原,利用杂交瘤技术建立抗河南华溪蟹MT mAb杂交瘤细胞株。采用间接ELISA测定mAb腹水效价,Western blot法、Dot-ELISA分析mAb的特异性。结果成功建立了2株稳定分泌抗MT蛋白的mAb杂交瘤细胞株,分别命名为mAb-MT2和mAb-MT3,均属于IgG1亚类。腹水效价分别为1∶500 000、1∶1000 000,Western blot和Dot-ELISA结果证实2株mAb均能特异性识别重组MT和内源性MT。结论成功制备了具有较高特异性的河南华溪蟹MT mAb。

急性铅对河南华溪蟹精巢和副性腺性腺指数及酸性磷酸酶活性的影响

为了研究铅(Pb^(2+))对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)的雄性生殖毒性,试验设置了1个空白对照组和5个Pb^(2+)浓度处理组(3.675,7.35,14.70,29.40,58.80 mg/L),分别进行了3,5,7 d的染毒,分析和测定了铅染毒后对精巢和副性腺的性腺指数以及酸性磷酸酶(ACP)活性的影响。结果显示,铅未造成性腺指数显著下降;随着铅染毒浓度的增大和染毒时间的延长,精巢和副性腺中ACP活性有下降趋势,58.8 mg/L铅处理下染毒7 d时,精巢中ACP活性显著降低(P<0.05),副性腺在染毒5,7 d时,58.8 mg/L铅处理组的ACP活性显著降低(P<0.05)。推测铅可能通过降低精巢和副性腺中ACP活性对雄性河南华溪蟹造成生殖毒性。