肝素黄杆菌发酵产肝素酶的工艺优化

以肝素黄杆菌为研究对象,提出了一种将发酵分为生长和产酶两个阶段的生产肝素酶的新工艺。对培养基组成进行了优化,优化后组成(g/L)葡萄糖8,氯化铵4,磷酸二氢盐6,组氨酸0.75,甲硫氨酸0.75,氯化镁0.5;微量盐10-4mol/L。菌体生长和产酶两个阶段的最优温度为27°C和23°C,pH为6.4和7.0。在诱导时加入10-4mol/LBa2+可以较好地消除SO2-4的阻遏作用。采用优化工艺,摇瓶产酶比原来提高了66%。

肝素黄杆菌菌种保存方法的研究

目的研究多种糖类对肝素黄杆菌细胞的保护作用及保藏菌种的方法。方法将多种糖类加入黄杆菌悬液,观察冷冻、冷藏、冷冻干燥过程中肝素黄杆菌的存活率,并将海藻糖和甘露醇添加进斜面固体培养基,观察菌种的有效保藏时间。结果糖类的加入明显提高了肝素黄杆菌菌种保存的存活率,其中以海藻糖和甘露醇效果最佳。结论在培养基中添加2%海藻糖或2%甘露醇可使菌株斜面冷藏保存时间延长2周。

添加核苷对肝素黄杆菌发酵产肝素酶的影响

研究了添加核苷对肝素黄杆菌发酵产肝素酶的影响,结果发现,单种核苷的添加会抑制产酶,而复合核苷的添加则促进产酶,当4种核苷的添加比例与肝素酶mRNA中4种相应核苷酸的比例一致时,促进作用最强。通过HPLC检测,证实添加后核苷很快进入了菌体内。HPLC的结果还表明,菌体内嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸的合成代谢可能不平衡,这对产酶是不利的。为此,还研究了通过添加天冬氨酸以增强嘧啶核酸合成代谢的调节方式,使产酶得到了提高。

急性脑血栓应用皮下注射低分子肝素钠联合奥扎格雷钠治疗的效果分析

目的观察皮下注射低分子肝素钠联合奥扎格雷钠治疗急性脑血栓患者的疗效。方法 120例急性脑血栓患者随机分为治疗组和对照组,每组60例。治疗组采用皮下注射低分子肝素钠(7 d)联合奥扎格雷钠注射液(14 d);对照组采用奥扎格雷钠注射液单药(14 d),观察两组间的疗效差别及治疗前后神经功能缺损程度恢复情况。结果治疗组总有效率91.7%优于对照组76.7%,差异有统计学意义(P<0.01);两组患者治疗后14 d神经功能缺损评分比较差异有统计学意义(P<0.01),治疗期间两组均未出现明显不良反应。结论皮下注射低分子肝素钠联合奥扎格雷钠治疗急性脑血栓效果较单用奥扎格雷钠注射液效果明显,安全性好,值得临床推广应用。

肝素黄杆菌肝素酶I的纯化

目的研究肝素黄杆菌素酶I的纯化方法。方法在中性低离子强度的磷酸盐缓冲液中,肝素酶能分别与DEAE和CM离子柱结合。基于此现象,提出了一种简便的肝素酶纯化工艺。结果粗酶液通过羟基磷灰石吸附-解吸附处理、DEAE-FF柱层析、CM-纤维素柱层析可获得电泳纯的肝素酶I。其比活为70.18U/mg蛋白,纯化倍数为159.5,酶活回收率13.4%。结论此纯化工艺比较简单,可获得电泳纯的肝素酶I。

肝素黄杆菌肝素酶性质的研究

目的研究肝素酶I的理化性质。方法测定肝素酶I的相对分子质量、等电点、紫外吸收光谱、N端序列,以及各种环境因素对酶活性和酶稳定性的影响。结果相对分子质量约为43×103,等电点为8.5。N端序列不能测到。酶的最适催化条件为:温度45℃,pH6.4～7.0,离子强度150mmol/L。酶在35℃以上极易失活,在pH7～11之间基本稳定。该酶的最大紫外吸收位于280nm。H2O2(1mmol/L,10mmol/L),NaN3(10mmol/L,100mmol/L),乙腈(1%,10%),1mol/L盐酸胍和1mol/L尿素对酶的活性无影响;1%SDS,4mol/L盐酸胍和4mol/L尿素则使酶完全失活;CaCl2和MgCl2是该酶的激活剂,FeCl2则对该酶的活性具有抑制作用。结论通过实验,测定了肝素酶I的主要理化性质。

肝素对大鼠缺血再灌注脑组织内肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的观察肝素对大鼠缺血再灌注脑组织内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法将50只大鼠随机分为A、B两组,制作脑缺血再灌注动物模型。A组给予肝素,B组给予生理盐水。然后应用ELISA方法,测定不同时间点时两组大鼠脑梗死灶内TNF-α含量。结果缺血前,两组大鼠脑内TNF-α均呈低水平表达。两组相比,差异不明显(P>0·05)。缺血3h再灌注3h、6h、24h、72h时,两组大鼠缺血侧脑内的TNF-α均呈高水平表达,但A组鼠脑内的TNF-α表达低于B组,具有显著性差异(P<0·05)。结论肝素不影响正常脑组织内低水平的TNF-α的表达,但能够抑制缺血再灌注脑组织内高水平的TNF-α的表达,对缺血再灌注脑组织具有一定的保护作用。

重组谷胱甘肽-S-转移酶-肝素酶Ⅰ在大肠杆菌中的表达、纯化及其性质

肝素酶Ⅰ(HeparinaseⅠ,HepⅠ)是一种多糖裂解酶,可特异性裂解硫酸肝素分子中糖苷键以制备低分子质量肝素(LMWH)。由于重组肝素酶Ⅰ在大肠杆菌中表达时极易形成包涵体,将肝素酶Ⅰ基因的N端融合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签,在大肠杆菌中进行低温表达。结果显示,约90%的GST-HepⅠ融合蛋白以可溶性形式表达,表达的目标蛋白粗酶经过一步亲和纯化,比活为124.7 U/mg,纯化倍数达到366.7倍,酶活回收率为31.0%;结果表明Ca2+对重组GST-HepⅠ有很强的激活作用,GPC-HPLC结果显示重组GST-HepⅠ与天然肝素酶Ⅰ裂解图谱相同。

肝素酶的发酵工艺研究

优化了发酵培养肝素黄杆菌生产肝素酶的半合成培养基配方,种子液种龄48h,接种量10%,装量90ml/(750ml摇瓶),25℃培养32h。采用该优化方案,肝素酶的发酵水平可达1768u/L,较合成发酵培养基提高52%。

重组黄杆菌肝素酶测活性方法的改进及影响因素的研究

目的提高Azure A法测活重组肝素酶的效率。方法通过缩短测定反应时间,提高酶活测定的效率。采用改进后的测活方法研究了温度、pH、盐离子浓度、不同金属离子对测活体系的影响。结果改进后的方法使肝素酶的测活效率提高了4倍,新的酶活测定方法最适反应条件为30℃,pH 7.0,盐离子浓度250 mmol/L。Cu2+对酶有轻微的激活作用,Pb2+、Mn2+则有较强的抑制作用。结论改进后的测活方法重复性好,测活效率大大提高。

肝素 地塞米松治疗皮瓣血运障碍临床研究

目的 探讨影响皮瓣血运障碍的原因及方法。 方法 根据导致皮瓣血运障碍的具体原因 ,进行综合治疗。 结果 10 8例皮瓣转移术后 ,采用综合方法治疗 ,皮瓣全部成活 ,效果满意。 结论 防治皮瓣血运障碍的方法很多 ,但必须在准确判断皮瓣情况的基础上 ,合理、综合应用才可获得满意的效果。

肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达

[目的]研究肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达。[方法]以肝素黄肝菌为模板,通过PCR从肝素黄杆菌基因组DNA中扩增2-O-sulfatase的基因,测序正确后插入到表达质粒PET-28a(+)上构建表达载体,重组质粒转化E.coil BL21(DE3)进行蛋白质表达。[结果]成功地将PCR扩增得到的测序正确的2-O-sulfatase基因构建入PET-28a(+)载体上,重组质粒转入E.coil BL21(DE3)后,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白。[结论]克隆并成功表达了黄杆菌2-O-sulfatase基因,为分析肝素多糖分子及其降解产物结构奠定了基础。

乌司他丁联合低分子肝素钙治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期的临床研究

目的:观察乌司他丁联合低分子肝素钙对慢性阻塞性肺病急性加重期患者的临床疗效。方法:选取162例AECOPD患者,分别分为乌司他丁治疗组55例,乌司他丁联合低分子肝素钙治疗组55例,常规治疗组52例。治疗前后评估例患者的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、纤维蛋白原(Fg)、D-二聚体(D-D)及肺功能情况。结果:乌司他丁联合低分子肝素钙治疗可显著提高AECOPD患者的肺功能情况,并且能改善患者炎症和凝血状态。结论:乌司他丁联合低分子肝素钙可作为AECOPD有效且安全的治疗手段。

肝素黄杆菌的明胶固定化

研究以明胶为载体、戊二醛作为交联剂制备固定化肝素黄杆菌的方法,并考察其固定化条件和酶学性质。论文对肝素黄杆菌细胞进行了缺壁处理,通过对明胶浓度、戊二醛浓度等条件的筛选和研究,确定了制备固定化肝素黄杆菌的最佳条件。此外,还对固定化细胞的酶学性质进行了初步研究,考察了温度、pH等因子对固定化细胞的影响。结果表明:明胶浓度15%、戊二醛浓度1.0%、1 mL明胶溶液固定0.3 g细胞,是最佳固定化条件;固定化细胞的最适温度37℃,最适pH 7.0,其酸碱稳定性与温度稳定性均得到了提高。综上所述,肝素黄杆菌在最佳条件下固定化后,具有较好的温度、酸碱、操作和贮藏稳定性。

重组黄杆菌肝素酶Ⅲ的纯化、表征及培养条件对酶生产的影响(英文)

肝素酶III是一种特异性地裂解乙酰肝素的酶,在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体。为实现肝素酶III的可溶性表达,利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与肝素酶III融合性能,通过构建相应的表达质粒pGEX-heparinaseIII,在大肠杆菌中实现了肝素酶Ⅲ的可溶性表达。粗酶通过一步亲和纯化其纯度可达95%以上。通过对LB培养基摇瓶培养Escherichia coli BL21的诱导时机、诱导剂用量、诱导时间等培养条件的优化,确定了该可溶性肝素酶III融合蛋白的最适生产条件。通过对纯酶的最适反应温度、pH、Ca2+浓度等一系列性质研究,确定了该酶的最适反应条件。