人Hepassocin的原核可溶性表达与纯化

目的:构建人Hepassocin的原核表达载体,可溶性表达并纯化得到高纯度的重组人Hepassocin。方法:将人Hep-associn基因克隆到原核表达载体pET40b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),于28℃经0.1mmol/LIPTG诱导6h,表达Ds-bC-Hepassocin融合蛋白,经镍柱纯化可溶性融合蛋白,用肠激酶切除融合蛋白的DsbC-His标签,再用镍柱纯化分离酶切后的Hepassocin,通过超滤进一步纯化并浓缩,用Westernblot验证纯化后的Hepassocin。结果:构建了pET40b-Hepassocin原核表达载体,经诱导表达、亲和层析和肠激酶切除融合标签,获得了相对分子质量约32000的可溶性高纯度蛋白,West-ernblot鉴定证实该蛋白为不含融合标签的重组人Hepassocin。结论:实现了人Hepassocin的原核可溶性表达,通过纯化获得了较高纯度的重组人Hepassocin,为制备其单克隆抗体,进一步研究其生物学功能奠定了基础。

Hepassocin:一种新型的肝细胞因子

Hepassocin(HPS)是一种肝细胞特异性分泌的蛋白质.研究发现,HPS能促进正常肝细胞增殖,抑制肝癌细胞增殖.HPS在急性肝损伤时能通过抑制肝细胞凋亡保护肝脏,并具有减轻高血糖所导致的肝细胞氧化应激的作用.在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者中,HPS的表达和分泌增多,其能诱导肝脂质合成和聚集.而在2型糖尿病患者中,血浆HPS浓度显著增加,与肝脏和骨骼肌等组织、器官的胰岛素抵抗有关.这些研究表明,HPS不仅可以调控肝细胞增殖和凋亡,还能参与NAFLD和2型糖尿病的发生、发展.

Hepassocin:一种作用特异的促肝细胞增殖因子

肝细胞增殖的调控机制复杂,众多的细胞因子参与其中,然而,大多数的细胞因子都不具备作用的特异性,它们除了对肝细胞发挥活性作用外,还具有调控其它组织细胞的活性。Hepassocin是一种分子量为34ku的多肽,在肝切除或肝损伤后表达升高,以同源二聚体的形式在肝再生过程中发挥重要功能。与HGF、EGF等其它肝增殖相关因子不同的是:Hepassocin是一种特异性的促肝细胞增殖因子。Hepassocin的特异性主要表现在以下3方面:特异性表达于肝脏实质细胞;特异性的作用于正常肝细胞;只对肝细胞有促增殖活性,对其它组织细胞无促增殖活性,同时具有一定的种属特异性。

肝活素转录激活肝源性细胞FOXA2抑制内质网应激

肝活素(hepassocin,HPS)是一种由肝合成和分泌的活性因子,参与肝再生与物质代谢,重组肝活素可以救治小鼠化学性肝损伤和非酒精性脂肪性肝炎,但其具体的分子机制仍需深入研究。前期采用RNA测序技术(RNA-seq)分析发现,HPS敲除小鼠肝中叉头框蛋白A2(forkhead box A2,FOXA2)的表达显著降低。FOXA2是肝内富集表达的重要转录因子,我们推测FOXA2可能是HPS调节肝多种生物学功能的关键靶点。本研究首先通过Western印迹和Real-time PCR证明FOXA2在HPS敲除小鼠肝组织中的表达显著降低(P<0.01),随后在细胞水平证明,重组HPS能显著增加FOXA2的表达(P<0.01)。通过克隆侧翼序列构建FOXA 2启动子报告基因,在此基础上通过大片段截断、精细缺失发现FOXA 2响应HPS信号的顺式作用元件位于转录起始位点上游-814~-797 bp,为肝细胞核因子6(hepatocyte nuclear factor 6,HNF6)的结合序列。通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)的结果证明,HPS可以促进HNF6与该序列的结合,并具有剂量依赖效应。通过慢病毒感染证明,在HPS敲除小鼠原代肝实质细胞中回补FOXA2会减轻内质网应激(P<0.01)。本研究为探索HPS调节肝功能稳态的分子机制提供了新的线索。

肝损伤患者血清肝活素水平测定的临床意义

目的探究肝活素(HPS)在阻塞性黄疸所致肝损伤的诊断以及慢性肝病肝功能评估中的作用。方法 ELISA法检测60例阻塞性黄疸患者、68例慢性肝病患者及30例健康体检者血清HPS水平。分析肝损伤患者与正常人血清HPS水平有无差异;对阻塞性黄疸患者血清HPS和丙氨酸氨基转移酶(ALT)进行相关性分析;绘制受试者工作特征曲线,观察HPS对阻塞性黄疸所致肝损伤的诊断价值;分析慢性肝病患者HPS与Child-Pugh分级(CPC)以及肝衰竭之间的关系。结果阻塞性黄疸和慢性肝病患者血清HPS水平均显著高于对照组(P<0.01)。阻塞性黄疸患者血清中HPS与ALT呈正相关性(rs=0.914,P<0.01);HPS在阻塞性黄疸肝损伤诊断中的曲线下面积达到0.938,最佳节点是141.87μg/L;慢性肝病中非衰竭者Child A、Child B、Child C与慢加急性肝衰竭、慢性肝衰竭5组之间两两比较,非肝衰竭组中,随着CPC升高,HPS水平也逐渐升高(P<0.05),两组肝衰竭血清HPS水平均高于非衰竭各组(P<0.05),两组肝衰竭之间HPS水平差异无统计学意义。结论血清HPS水平测定能够对阻塞性黄疸患者有无肝损伤作出诊断,也能够辅助CPC评估慢性肝病患者肝功能。

肝活素酶联免疫吸附分析方法的建立及应用

目的 建立肝活素（Hepassocin）酶联免疫吸附分析方法（ELISA）。方法 使用两株抗体,一株包被微孔板,另外一株用HRP标记。显色系统使用TMB显色。结果 测定范围在20~1000ng/mL,最低检测限在10ng/mL,回收率在93.9%~103.1%之间,批内和批间变异为9.7%和7.8%,正常参考值为〈20ng/mL。结论 用1000份临床样本考核本试剂盒,与参比试剂盒有很好的临床符合性,与参比试剂盒具有同等的临床使用价值。

人肝细胞脂筏区蛋白质组学研究揭示肝活素新机制

肝活素(hepassocin, HPS)是一种重要的肝细胞活性因子,主要表达于肝组织,少量表达于胰腺。目前研究表明,肝活素通过非受体酪氨酸激酶(Src proto-oncogene, non-receptor tyrosine kinase, Src)/表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)途径诱导L02细胞增殖,小窝蛋白1(caveolin 1, CAV1)在肝活素刺激下调节L02细胞G1/S期细胞周期行进。但肝活素诱导细胞增殖的分子机制仍不明确。Src、EGFR和CAV1均定位在脂筏中。因此推测,肝活素可能通过脂筏发挥作用。本研究首先验证了一种快速有效的分离脂筏区蛋白质提取方法。基于此方法提取脂筏区蛋白质,以磷酸酪氨酸单克隆抗体(p-Tyr)进行免疫共沉淀分析,通过对人肝细胞脂筏区蛋白质组学研究和分析后,聚焦于信号传导与转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)通路。Western印迹和间接免疫荧光结果表明,肝活素刺激可显著活化STAT3通路,促进STAT3入核,上调其下游靶基因MYD88天然免疫信号转导适配器(innate immune signal transduction adaptor, MYD88),蛋白酶体20亚基β8(proteasome 20S subunit beta 8, PSMB8), TRIM21 (tripartite motif containing 21)和内质网氨基肽酶1(endoplasmic reticulum aminopeptidase 1, ERAP1)(^****P<0.0001,^***P<0.001,^**P<0.01,^*P<0.05)的表达。分别抑制p-EGFR和Src后,肝活素对STAT3的活化作用消失。阻断STAT3通路明显抑制肝活素的促肝细胞增殖功能(^P<0.05)。综上所述,肝活素刺激可活化STAT3通路。本研究为肝活素的功能和作用机制提供新的线索。

肝活素(HPS)——一种新的小鼠急性肝损伤标志物

目的急性肝衰竭是目前临床上导致死亡的重要病因之一,研究具有肝特异性、灵敏度高的肝损伤标志物对于严重肝病的早期诊断以及预后预测具有重要的意义。肝活素(hepassocin,HPS)是一种具有高度组织特异性的促肝细胞增殖活性因子,在动物水平检测其在血清中的表达水平与肝损伤程度的相关性将为其开发成临床检测急性肝损伤的特异性标志物奠定基础。方法利用腹腔注射不同剂量CCl4处理诱导小鼠急性肝损伤模型,检测小鼠的存活率、转氨酶水平以及肝病理变化。通过ELISA检测小鼠血清的HPS水平;实时PCR法检测HPS mRNA水平;Western印迹法检测HPS的蛋白表达水平。结果随着CCl4处理剂量的增加,小鼠死亡率显著升高,肝损伤程度显著增加,在此过程中,HPS在小鼠血清及肝组织中的表达水平也显著上调,并与肝损伤程度密切相关。结论HPS可做为一种新的小鼠肝损伤标志物。

重组人肝活素(HPS)的制备及其对四氯化碳诱导肝细胞损伤的保护作用研究

目的肝活素(hepassocin,HPS)是一种具有促肝细胞生长,保护肝细胞免于损伤的肝特异性生长因子,研究其保护机制将为肝病的防治机制提供重要的实验依据。方法通过真核表达系统获得重组人HPS,通过Ed U掺入实验检测其活性。用四氯化碳(CCl4)建立肝细胞损伤模型,在此基础上用不同浓度HPS进行处理或干涉内源HPS,检测细胞上清中转氨酶、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽转移酶的变化。结果制备的HPS纯度达到95%以上,具有良好的促细胞增殖活性。10%CCl4处理可致肝细胞损伤,HPS处理可显著降低转氨酶及LDH水平,增加SOD及谷胱甘肽转移酶的水平;干涉HPS则显著增加转氨酶及LDH水平,降低SOD及谷胱甘肽转移酶的水平。结论 HPS可通过增强肝细胞的抗氧化能力减轻肝细胞损伤。