抗HBcAg人源性单链抗体细胞内表达及其抗病毒复制的实验研究

应用人源性抗HBcAg单链抗体细胞内表达技术 ,探讨抗HBV复制基因治疗的应用价值。应用噬菌体展示和基因重组技术 ,从HBV感染的外周血淋巴细胞克隆了人源性抗HBcAg单链抗体 ,并重组至逆转录病毒载体。以人肝癌细胞smmc - 772 1和PLC/PRF/5为靶细胞进行基因共转染 ,分别测定实验组细胞上清中的HBsAg和HBeAg ,与对照组做比较 ,观察抗HBcAg单链抗体细胞内表达的抗病毒治疗作用。结果显示 ,在急性HBV感染的细胞株中 ,抑制病毒复制效率为 4 9%～ 6 1% ,在慢性病毒感染细胞 ,抑制率为 4 1%～ 5 4 %。实验结果表明 ,应用单链抗体细胞内表达技术 ,在抗病毒治疗研究中具有潜在的应用价值。应对HBV的 4个开放阅读框架编码产物进行全面的对比研究 ,以发现抑制效率高。

抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法 以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原 ,利用抗原 抗体亲和性结合的原理 ,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验 (ELISA)和DNA序列分析 ,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体 ;用该抗体对 772 1转染全长HCVcDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明 ,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合 ;免疫组化结果表明 ,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原 ,与正常肝细胞无交叉反应。结论 此法制备单链抗体方法简便 ,周期短 ,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。

乙肝病毒核心蛋白人源单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的获得可溶性的抗乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（core ）的人源单链可变区抗体（ScFv），为得到纯度高、活力强的HBc-ScFv和进一步的抗HBV 治 疗奠定基础。方法采用噬菌体表面展示技术，以重组的HBV核心蛋白为包 被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程，获得抗原 结 合活性较强的乙型肝炎核心蛋白人源单链可变区抗体ScFv 片段克隆，并对其进行DNA序列及 免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化大肠杆菌HB2151，IPTG诱导表达乙型 肝炎核心蛋白可溶性人源单链可变区抗体，ELISA和western blot检测其抗原结合特异性。 结果克隆了乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体基因；经DNA酶切和序列 分析表明，该抗体基因由771个碱基组成；ELISA 和western blot结果表明：在大肠杆菌HB2 151中经IPTG诱导表达的可溶性乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体，具有结合乙型肝炎核 心蛋白的特异性和免疫活性。结论克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表 达了可溶性的HBc-ScFv。

HBsAg人源噬菌体单链抗体的筛选及其在临床诊断中的应用

目的 筛选乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原 (HBsAg)的人源噬菌体单链抗体 ,并探讨其在临床治疗和诊断中的应用价值。方法 以HBsAg阳性血清超速离心纯化的HBsAg为固相抗原 ,从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体 (ScFv) ;用该抗体对 10例石蜡包埋的乙型肝炎患者肝组织进行免疫组化鉴定。结果 酶联免疫吸附法 (ELISA)结果表明 ,制备的HBV人源单链抗体能与HBsAg抗原特异性结合 ;免疫组化结果表明 ,该抗体能够特异性识别乙型肝炎患者肝组织中的HBsAg抗原 ,与正常肝组织及丙型肝炎病毒 (HCV)的抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好 ,特异性强 ,且制备方法简便 ,周期短 ,为HBV病原的检测提供了新的有效试剂 ,为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。

非复制型腺病毒介导抗-HBC单链抗体的细胞内表达

目的 探讨非复制型腺病毒介导抗-HBc单链抗体（ScFv）细胞内表达效率，并确定是否具有特异性抗原结合活性。方法 将经细菌内同源重组并在293细胞中包装产生的携带抗-HBcScFv基因的非复制型重组腺病毒，按感染复数为10体外转染HepG2细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达；取培养上清液和细胞裂解上清液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot法检测HBc ScFv表达。结果 重组腺病毒Ad-ScFv感染HepG2细胞后，荧光显微镜下观察到HepG2细胞中绿色荧光蛋白；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳显示培养上清液和细胞裂解物中可见2．7×10^4左右的蛋白条带；Western blot显示有乙型肝炎核心抗原特异性结合活性阳性反应条带出现。结论 携带抗-HBc ScFv基因的非复制型重组腺病毒能在真核细胞中有效表达抗-HBc ScFv，并具有特异性抗原结合活性。

人源抗丙型肝炎病毒包膜蛋白E2单链抗体的研究

目的 研制抗丙型肝炎病毒包膜蛋白Ｅ２（ＨＣＶ Ｅ２）的人源噬菌体单链抗体，并探讨其临床价值。方法 以重组的ＨＣＶ Ｅ２为固相抗原，利用亲和筛选的原理，从噬菌体抗体库中经过５轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和ＤＮＡ序列分析，获得ＨＣＶ Ｅ２的人源单链抗体；用该抗体对１０例石蜡包埋的丙型肝炎患者肝组织进行免疫组织化学鉴定。结果 ＥＬＩＳＡ结果表明，制备的ＨＣＶ Ｅ２人源单链抗体（吸光度值Ａ４５０为 １．８８）能与ＨＣＶ Ｅ２抗原特异性结台；免疫组织化学结果表明，该抗体能够特异性识别丙型肝炎患者肝组织ＨＣＶ Ｅ２抗原，与正常肝组织及乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好，特异性强，且制备方法简便，周期短，为ＨＣＶ Ｅ２病原的检测提供了新的有效的试剂。