真鲷鳃组织cDNA文库的构建与hepcidin抗菌肽基因序列的扩增

以细菌攻毒的真鲷鳃组织为材料，分离出mRNA，合成双链后，回收500～4000bp cDNA片段，构建了λZAP表达型cDNA文库。初级文库的容量为1．75×10^5个重组子，扩增文库的滴度达到1×10^9pfu·mL^-1，随机挑选噬菌斑的插入片断在500～2000bp之间。以hepcidin特异性引物做PCR扩增文库，获得了hepcidin抗菌肽基因cDNA序列，证明所建立的文库可用于免疫相关基因的筛选。本文库可作为筛选真鲷免疫相关基因的重要资源。

大菱鲆hepcidin抗菌肽基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

通过同源克隆结合RACE的方法从大菱鲆(Scophthal mus maximus)肝脏中克隆了大菱鲆hepcidin抗菌肽基因全长cDNA(GenBank accession number AY994074)。大菱鲆hepcidin基因cDNA全长778bp,包含有1个273bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽。将大菱鲆hepcidin抗菌肽基因的成熟肽序列重组至原核表达载体pGEX-4T-1中,用IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示在29ku处有特异性蛋白条带出现,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白约占总蛋白的26%。Western-blotting分析发现表达的融合蛋白可以特异性地与GST抗体相识别。这些结果表明大菱鲆hepcidin抗菌肽基因成功实现了原核表达。

黄鳝Ⅰ型hepcidin抗菌肽基因的诱导表达分析

采用RT-PCR的方法对健康黄鳝(Monopterus albus)不同组织Ⅰ型抗菌肽hepcidin基因的表达情况及受脂多糖(LPS)注射、嗜水气单胞菌感染后该基因的表达情况进行了分析。结果表明:在正常黄鳝各组织中,该基因在肝脏中表达量最高,其次是肾脏,在心脏、皮肤、脑、血液、小肠、脾脏和胃中的表达量较低,而在肌肉中没有检测到该基因的转录本;LPS注射24h后,各组织里的hepcidin基因表达量都有明显升高;当受到病原菌感染后,在所检测的肝脏、肾脏、皮肤、脑、心脏和脾脏等6个组织中该基因的转录本都在感染后24h后急剧上升。这些结果表明黄鳝的Ⅰ型抗菌肽hepcidin基因可能在黄鳝抵抗外界病原物侵染过程中起着重要作用。

草鱼TAB2与TAK1蛋白互作鉴定及其对两种抗菌肽基因表达的影响

为了探究草鱼TAB2(Ci TAB2)与Ci TAK1能否互作及其对2种草鱼抗菌肽基因(Cihepcidin与Ciβ-defensin1)表达的影响,实验首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析拟态弧菌感染后Citab2和Citak1在草鱼免疫相关组织中的时空表达模式。然后利用荧光共定位、免疫共沉淀及Western blot技术鉴定Ci TAB2与Ci TAK1在细胞内共定位及相互作用情况。最后将过表达质粒pEGFP-N1-Citak1与pEGFP-N1-Citab2共同转染草鱼肾细胞(CIK细胞),检测Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平。结果显示,拟态弧菌感染能够显著改变Citab2和Citak1的相对表达水平,前者于感染后不同时间在各检测组织中表现出不同的时空表达模式,而后者均呈现先上调后下调的表达模式;荧光显微镜下观察到Ci TAB2与Ci TAK1共定位于转染后的HEK293T和CIK细胞的胞质中,且在HEK293T细胞内能够形成Ci TAB2-Ci TAK1蛋白复合物;共同过表达Ci TAB2与Ci TAK1后,CIK细胞内Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调。结果表明,Ci TAB2与Ci TAK1存在互作关系且二者互作能够促进上述两种抗菌肽的转录表达。本研究从蛋白互作调控抗菌肽表达的角度为防治鱼类弧菌病提供了新策略。

海水养殖鲈鱼分离出一种hepcidin抗菌肽新基因

利用分子生物学技术,从我国海水养殖鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)分离到一种hepcidin抗菌肽新基因,并在国际GenBank公布(accessionnumber为AY547281).初步研究结果表明,在我国鲈鱼分离到的hepcidin基因属于hep cidin抗菌肽基因家族的新成员.

中华乌塘鳢NK-lysin基因的克隆鉴定、表达分析及抗菌功能研究

NK-lysin是一种具有广谱抗菌活性和免疫调节功能的阳离子抗菌肽。通过分子克隆方法获得中华乌塘鳢的NK-lysin基因(BsNKL)cDNA序列。BsNKL编码152个氨基酸,包含1个信号肽、1个SapB结构域和6个保守半胱氨酸残基。基因表达分析表明,BsNKL在主要器官组织中均有表达,副溶血弧菌感染能够引起BsNKL表达量在脾脏、头肾和鳃中发生显著变化。中华乌塘鳢BsNKL抗菌肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌等4种细菌均具有较好的抑菌活性。腹腔注射BsNKL能够为细菌感染的中华乌塘鳢提供有效的免疫保护并显著提高其存活率。综上所述,BsNKL在中华乌塘鳢抗细菌感染天然免疫应答方面发挥重要作用。

黏虫新型抗菌肽Mysdiap基因克隆、序列分析及原核表达

利用反转录PCR(RT-PCR)和末端快速扩增(RACE)技术从三龄黏虫体内获得新型抗菌肽Diapausin基因的全长序列,利用生物信息学软件对该序列进行分析,并用原核表达体系对其进行诱导表达,为探究该基因的结构和功能提供理论参考。结果表明,成功克隆到了黏虫新型抗菌肽Diapausin基因,命名为Mysdiap(GenBank登录号:AZJ51075)。该基因全长537 bp,其中5′端和3′端非编码区分别为63,279 bp,开放阅读框全长195 bp,编码64个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为7.13 ku,等电点为5.59。Mysdiap的N端前24个氨基酸残基为信号肽序列。多重联配结果表明,Mysdiap氨基酸序列中具有高度保守区域ECCRAHG。成功构建了pET-Mysdiap重组表达质粒,并在大肠杆菌中用IPTG诱导其表达,表达的重组蛋白分子质量在20 ku左右,以包涵体和可溶性蛋白形式存在。综上,从黏虫中克隆获得了新型抗菌肽基因Mysdiap的全长序列,并在大肠杆菌中成功诱导其表达。

斜带石斑鱼抗菌肽hepcidin基因克隆及其成熟肽的原核融合表达

文章根据已报道的硬骨鱼类hepcidin cDNA序列设计简并引物，通过RT—PCR从重要海水经济鱼类斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）肝脏中扩增出1条具有完整开放阅读框的246bpcDNA序列，Blast分析表明该序列是鱼类hepcidin基因家族的一员，被命名为斜带石斑鱼hepcidin样抗菌肽前体，该cDNA所推导的氨基酸序列有如下特点：1）信号肽序列与多数鱼类hepcidin信号肽的同源性在67％～87％之间；2）C端20个氨基酸序列具有绝大多数动物hepcidin成熟肽的共同典型保守序列特征，即在对应位置具有8个Cys；3）序列中不具有已报道的hepcidin前体肽转化酶作用典型基序[RX（K／R）R]；4）与GenBank中已注册的2条斜带石斑鱼hepcidincDNA序列（GU391241和GU391242）所推导的氨基酸序列同源性分别为36％和33％，且NJ进化树显示不与这2条序列聚为一枝，表明该序列是斜带石斑鱼hepcidin基因家族中一种新亚型，其预测成熟肽融合表达载体成功在大肠杆菌（Escherichiacoli）中表达，为后续研究奠定基础。

饲料中维生素D_3水平对黄鳝抗菌肽hepcidin基因表达的影响

本试验旨在探索饲料中维生素D3水平对黄鳝(Monopterus albus)抗菌肽hepcidin基因表达的影响。挑选体质健康、平均体重为(21.7±2.1)g的黄鳝360尾,随机分为6组,每组2个重复,每个重复30尾。6组黄鳝分别饲喂在基础饲料(0 IU/kg维生素D3)中添加0、250、500、1 000、2 000和4 000 IU/kg维生素D3的试验饲料。于投喂试验饲料后20、40和60 d,从各组随机选择6尾黄鳝,分别采集其肝胰脏、脾脏、头肾和后肠组织,采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测样品中hepcidin基因表达量。结果表明:投喂20、40和60 d后,黄鳝4种组织中均有hepcidin基因表达,并且肝胰脏中显著高于脾脏、头肾和后肠中(P<0.05);随维生素D3添加水平的增加,黄鳝hepcidin基因在4种组织的表达量同一时间点均呈现出先升高后降低的趋势;第20天时4种组织中的表达量均以2 000 IU/kg组为最高,显著高于其他各组(P<0.05);第40和60天时肝胰脏、头肾中的表达量均以500 IU/kg组为最高,其中第40天时显著高于0、250、4 000 IU/kg组(P<0.05),第60天时显著高于其他各组(P<0.05)。结果提示,短期(20 d)内在饲料中添加2 000 IU/kg的维生素D3可显著提高黄鳝内脏组织中hepcidin基因的表达量;饲喂周期较长(40或60 d)时,饲料中添加500 IU/kg维生素D3可显著提高hepcidin基因在黄鳝肝胰脏和头肾中的表达量。

俄罗斯鲟肝脏表达抗菌肽2基因的分子特征及抗菌活性分析

肝脏表达抗菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide 2,LEAP-2)在鱼类先天免疫系统中发挥重要作用。本研究通过RACE技术获得了俄罗斯鲟LEAP-2(Acipenser gueldenstaedti LEAP-2,AgLEAP-2)的全长c DNA序列,对其序列特征和表达水平进行了分析;构建Ag LEAP-2原核表达载体并对重组蛋白进行纯化;进一步采用琼脂稀释法初步检测Ag LEAP-2蛋白的抑菌活性。结果显示,AgLEAP-2基因c DNA全长为622 bp,开放阅读框(ORF)为246 bp,预测编码81个氨基酸,分子量约为11.2 kDa,5′端非编码区为184 bp,3′端非编码区为192 bp。Ag LEAP-2包含一个信号肽(1~25 aa)和一个成熟肽(26~81 aa),成熟肽含有4个保守的半胱氨酸残基,在Cys58-Cys69和Cys64-Cys74的相对位置之间各形成一个二硫键的核心结构。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,AgLEAP-2在所有健康组织中广泛表达,在肝脏中表达水平最高,在肠道和肌肉中表达水平次之,在鳃中表达量最低。与0 h相比,Ag LEAP-2在感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后的不同时间点的肝脏、脾脏、肠道、头肾、鳃和血液组织中均显著上调。此外,重组Ag LEAP-2蛋白(r Ag LEAP-2)在体外对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抗菌活性并存在剂量效应。本研究表明,AgLEAP-2可能在俄罗斯鲟的先天免疫系统中发挥重要作用且对多种病原菌有一定的抗菌效果,本研究为开发新的抗菌制剂提供了依据。

牙鲆抗菌肽hepcidin基因在成鱼组织和不同发育时期胚胎中的表达分析

抗菌肽hepcidin是由hepcidin基因编码产生的小分子多肽,是机体天然免疫的重要因子。本文利用RT-PCR的方法分析表明,抗菌肽hepcidin基因在牙鲆成鱼不同组织和不同发育时期胚胎中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异。

黄鳝抗菌肽hepcidin基因cDNA的克隆及表达分析

根据已知鱼类抗菌肽hepcidin的同源性设计简并引物,利用同源克隆结合RACE法从黄鳝(Monopterus albus)肝脏中扩增得到了黄鳝hepcidin基因全长cDNA序列(GenBank accession number FJ436808).结果表明,黄鳝hepcidin基因cDNA全长712bp,5′端非翻译区有133bp,3′端非翻译区有306bp,包含1个273bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽.同源性分析表明,黄鳝hepcidin推测的氨基酸序列与其他鱼类报道的hepcidin具有较高的同源性,并具有8个半胱氨酸这一典型特征,是hepcidin家族的1个新成员.采用半定量PCR法对该基因在健康成体不同组织的转录本和脂多糖(LPS)对该基因表达的影响进行了分析.结果发现,该基因在肝脏中表达量最高,其次是肾脏,在心脏、皮肤、脑、血液、小肠、脾脏和胃中的表达量较低,而在肌肉中没有检测到该基因的转录本;LPS注射24h后,各组织的hepcidin基因表达量都有明显升高.

海水养殖花鲈鳃组织hepcidin-like抗菌肽基因克隆与序列分析

本研究利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(3′RACE)克隆出海水养殖花鲈(Lateolabrax japonicus)鳃组织hepcidin-like抗菌肽基因cDNA(523bp),包含完整的编码区、3′端非翻译区(3′UTR)和典型的多腺苷酸化信号(AATAAA).该基因编码86个氨基酸,由信号肽、优势域和成熟肽组成.与花鲈肝脏分离到hepc1及国外发表白鲈(Morone chrysops)hepcidin氨基酸序列进行比较,结果显示花鲈鳃hepcidin-like基因编码的氨基酸与它们在27个位点上存在着差异;该hepci-din-like基因可能为hepcidin的不同变体,属于hepcidin抗菌肽家族的新成员.

斑节对虾新型抗菌肽ALF-like基因克隆表达及其抗菌功能分析

【目的】克隆并明确斑节对虾(Penaeus monodon)新型抗菌肽ALF-like基因(PmALF-like)的结构特征、组织表达分布规律及副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)刺激后的表达变化,探究其在抗菌先天免疫中的作用与功能,为阐明斑节对虾抗菌免疫调控机制提供参考依据。【方法】依据PmALF-like基因表达序列标签(EST)序列,利用RACE扩增获得PmALF-like基因cDNA全长序列,通过ProtParam、SignalP 5.0、MegAlign和MEGA 7.0等在线软件进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测PmALF-like基因在斑节对虾不同组织中的表达特征及其在副溶血弧菌刺激后的表达模式;利用原核重组方法获得PmALF-like成熟肽的重组蛋白(去信号肽),并通过液体培养基法和牛津杯法等探究Pm ALF-like成熟肽抑制细菌生长的作用。【结果】PmALF-like基因cDNA序列全长1242 bp,包括45 bp的5’端非编码区(5’-UTR)、798 bp的3’端非编码区(3’-UTR)和399 bp的开放阅读框(ORF),共编码132个氨基酸残基;分子量为15.26k D,理论等电点(pI)为7.67;利用SignalP5.0对PmALF-like蛋白进行信号肽预测,结果表明其第18个氨基酸处存在信号肽剪切位点。实时荧光定量PCR检测结果表明,PmALF-like基因在斑节对虾血淋巴、肝胰腺、鳃、肠道、肌肉等组织中均有不同程度的表达,以肝胰腺中的相对表达量最高,血淋巴次之,肌肉组织中的相对表达量较少。副溶血弧菌刺激后,斑节对虾肝胰腺组织PmALF-like基因产生免疫应答,其基因相对表达量在6~72 h显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调。利用原核表达方法在体外成功获得不含信号肽的PmALF-like成熟肽,借助液体培养基法和牛津杯法发现PmALF-like成熟肽对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、副溶血弧菌及嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的生长均有明显抑制作用。【结论】PmALF-like基因在斑节对虾各组织中广泛表达,其成熟肽对维氏气单胞菌、副溶血弧菌及嗜水气单胞菌的生长具有明显抑制作用。

牙鲆抗菌肽hepcidin基因在大肠杆菌中的融合表达

根据从实验室克隆的牙鲆抗菌肽hepcidin基因（GenBank登陆号DQ129693）的序列,设计了特异性引物,PCR扩增其成熟肽片段.重组至融合表达载体pGEX-4T-1中,构建成牙鲆抗菌肽hepcidin基因融合表达载体pGEX-fhep,转化至大肠杆菌BL21（DE3）plyS中,筛选得到的阳性克隆用IPTG进行诱导.SDS-PAGE电泳显示在29kD处有特异性的蛋白条带出现,Western-blotting 检测表明已经成功表达了融合蛋白,表达的融合蛋白最高占总蛋白的21%.纯化得到的GST-fhep用凝血酶切割后,用亲合层析得到牙鲆的抗菌肽hepcidin.抑菌实验结果表明抗菌肽对大肠杆菌（ATCC25922）有一定程度的抑制作用.

牙鲆抗菌肽hepcidin基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的方法设计简并引物从牙鲆（Paralichthys olivaceus）肝脏中克隆了牙鲆hepcidin抗菌肽基因。牙鲆抗菌肽hepcidin基因组DNA全长821bp，序列分析表明该基因具有3个外显子和2个内含子。cDNA全长588bp，包含一个270bp的开放阅读框，编码一个长89氨基酸的前体肽。RT-PCR分析表明：该抗菌肽基因在正常牙鲆的肝脏、头肾、鳃、脾脏中表达量较高，在心脏、小肠中表达量较低；受到病原鳗弧菌感染的牙鲆各组织该基因表达量明显上升。牙鲆抗菌肽基因的克隆为水产养殖等领域的抗耐病品种的选育提供了基因源，为开发新的生物工程药物提供了基础理论和实验数据。

中华鳖抗菌肽Hepcidin成熟肽基因的克隆及同源性的初步研究

采用同源克隆的方法,以用于扩增大菱鲆hepcidin成熟肽基因的引物,从中华鳖肝脏cDNA中扩增得到1条长78 bp的基因片段.初步判断其属于Hepcidin家族,与HAMP1具有较高的同源性,分析表明其为Hepcidin成熟肽.根据基因序列推断得到的成熟肽蛋白序列如下:QSHISLCRWCCNCCKANKGCGFCCKF.与其他物种的成熟肽进行比对,发现其与大菱鲆的成熟肽序列同源性达到100%,并构建了基于各物种Hepcidin前体肽的系统发育树,为研究物种进化提供了证据.

基于LC-MS/MS和比较基因组学技术解析海洋源解淀粉芽孢杆菌CMT-9产抗菌脂肽的分子机理

为探究海洋源解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CMT-9产抗菌脂肽的分子机理。采用高效液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术检测CMT-9发酵液的主要组分,结合Illumina高通量测序解析CMT-9的全基因组信息,并将其与B.velezensis CMT-6、B.amyloliquefaciens DSM7T、B.velezensis FZB42和B.subtilis 168中脂肽合成相关的代谢通路和关键基因进行比较分析。结果表明,CMT-9的发酵液含有表面活性素、伊枯草菌素、芬荠素3种脂肽。全基因组测序分析发现,CMT-9菌株染色体的基因组全长为3928149 bp,G+C含量为43.39%,tRNA数量为83,rRNA为9。通过GO、KEGG、COG数据库比对,其差异基因主要富集在碳水化合物代谢和氨基酸代谢等合成脂肽的相关通路;脂肽谱相近的菌株CMT-9、CMT-6、FZB42在基因组组分、G+C含量、共线性、同源性和共有基因中均表现出高度的一致性。该研究通过LC-MS/MS和比较基因组学技术联用解析芽孢杆菌脂肽谱的差异及其分子机理,以期为脂肽高产菌株的筛选及基因库的构建提供理论基础。

黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体。[方法]根据Genbank中黄鳝hepcidin基因序列设计引物进行PCR扩增,将测序正确的基因片段连接入载体pET-28a中。[结果]以黄鳝cDNA为模板,扩增出hepcidin基因片段,长度为291 bp,连接到pET-28a上。经PCR扩增、双酶切验证,证实成功构建原核表达载体。[结论]成功构建了黄鳝hepcidin基因大肠杆菌表达载体。

抗菌肽基因转化樱桃矮化砧木获得抗根瘤病的转基因植株

建立了樱桃（PrunuspseudocerasusLindl．）矮化砧木茎尖高频再生系统，并利用根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens（SmithetTownsend）Conn）介导将gus及抗菌肽基因导入樱桃矮化砧木，获得19个转化株系。经Southernblot检测证明，抗菌肽基因已整合到樱桃的基因组。转基因植株接瘤实验、gus基因表达产物的颜色反应及叶片提取液对根癌土壤杆菌C58的抑菌实验表明，抗菌肽基因在转化植株中可能已得到有效表达，试管苗具有明显的抗根瘤病特性。还研究了茎尖分生组织的种质转化特点，结果表明它是一个较好的转化系统，可获得较高的转化频率。