背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供...背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。目的:构建小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体,以建立稳定转染的RAW264.7细胞株,为深入探讨SLC1A5在炎症中的作用提供实验基础。方法:根据SLC1A5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应扩增该基因片段。将目的基因定向接入经Age I/Nhe I酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒,对阳性克隆进一步筛选后测序比对结果;pHelper1.0质粒载体、pHelper2.0质粒载体、目的质粒载体与293T细胞共同培养并转染,获得慢病毒原液进行包装和滴度测定;在此基础上,通过体外培养RAW264.7细胞,确定嘌呤霉素工作质量浓度;不同滴度的慢病毒分别与RAW264.7细胞共同培养,根据荧光强度确定转染效率;用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测稳定转染细胞株的SLC1A5基因和蛋白表达水平。结果与结论:(1)测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功;(2)过表达SLC1A5慢病毒的滴度为1×10~9 TU/mL,敲低SLC1A5慢病毒的滴度为3×10~9 TU/mL;(3)确定RAW264.7细胞嘌呤霉素工作质量浓度为3μg/mL;(4)过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50;(5)过表达SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量明显上调,而敲低SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量显著下调。结果表明,成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株。展开更多
【目的】研究旨在对努比亚山羊大脑富集Ras同源物(Ras homolog enriched in brain,Rheb)基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体,为进一步揭示Rheb对努比亚山羊骨骼肌调控的分子机理奠定基础。【方法】试验采用RT-PCR方法从努比亚山...【目的】研究旨在对努比亚山羊大脑富集Ras同源物(Ras homolog enriched in brain,Rheb)基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体,为进一步揭示Rheb对努比亚山羊骨骼肌调控的分子机理奠定基础。【方法】试验采用RT-PCR方法从努比亚山羊背最长肌组织中扩增Rheb基因,经琼脂糖凝胶电泳及测序验证正确后进行生物信息学分析,同时构建该基因真核表达载体,转染细胞后进行实时荧光定量PCR检测来验证所构建载体的正确性。【结果】努比亚山羊Rheb基因编码区序列长度为555 bp,编码184个氨基酸,Rheb蛋白分子式为C 910 H 1456 N 236 O 279 S 6,分子质量为20359.34 u,原子总数为2887,理论等电点为5.93。Rheb蛋白属于稳定的亲水性蛋白,不包含跨膜结构域。蛋白二级结构预测结果显示,努比亚山羊Rheb蛋白中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占40.76%、7.07%、22.83%和29.35%。构建的真核表达载体pcDNA3.1-Rheb转染山羊骨骼肌细胞后,与空载体组相比,Rheb基因表达量极显著升高(P<0.01)。【结论】本试验成功克隆努比亚山羊Rheb基因编码区序列,并构建pcDNA3.1-Rheb真核表达载体,这为深入理解Rheb基因在努比亚山羊肌肉中的作用提供了理论支持。展开更多
【目的】试验旨在探究CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,CEBPA)基因在如皋黄鸡中的生物学特征、组织表达水平,并构建其表达载体。【方法】对如皋黄鸡CEBPA基因CDS区进行克隆并测序,与其他物种进行相似性比...【目的】试验旨在探究CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,CEBPA)基因在如皋黄鸡中的生物学特征、组织表达水平,并构建其表达载体。【方法】对如皋黄鸡CEBPA基因CDS区进行克隆并测序,与其他物种进行相似性比对及系统进化树构建,通过生物信息学软件对如皋黄鸡CEBPA蛋白的理化性质、磷酸化位点、糖基化位点、功能结构域、互作蛋白及二级结构、三级结构进行预测。利用实时荧光定量PCR技术检测CEBPA基因在如皋黄鸡心脏、肝脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、腺胃、肌肉、睾丸中的表达情况。构建CEBPA基因过表达(OE-CEBPA)和干扰载体(CEBPA-sh12,CEBPA-sh167,CEBPA-sh727),并检测各载体活性。【结果】如皋黄鸡CEBPA基因CDS区序列全长975 bp,共编码324个氨基酸。相似性比对结果显示,如皋黄鸡与日本鹌鹑、鸿雁、野鸽、野鸭的CEBPA氨基酸序列相似性均>94%,其中与日本鹌鹑的相似性最高,达99.4%;系统进化树结果表明,如皋黄鸡与日本鹌鹑的亲缘关系较近,与哺乳动物的亲缘关系较远。如皋黄鸡CEBPA蛋白为亲水不稳定蛋白,存在25个磷酸化位点,含9个N-糖基化位点和109个O-糖基化位点;CEBPA蛋白具有1个转录激活区和1个与DNA结合的亮氨酸拉链结构bZIP;如皋黄鸡CEBPA蛋白二级结构主要由193个无规则卷曲、93个α-螺旋、25个延伸链和13个β-转角组成,三级结构预测结果与二级结构基本一致;CEBPA蛋白主要与TRIB1、PPARG、RXRA、MAPK9、MAPK10、JUN、ESR1等蛋白互作。CEBPA基因在如皋黄鸡各组织中均有表达,其中以肝脏中表达量最高。成功构建CEBPA过表达载体和3个干扰载体,将它们分别转染至鸡成纤维细胞,与对照组相比,过表达组(OE-CEBPA)CEBPA基因表达量显著升高(P<0.05),干扰组(CEBPA-sh167)CEBPA基因表达量显著下降(P<0.05)。【结论】试验获得如皋黄鸡CEBPA基因完整CDS区并成功构建与筛选出具有过表达/干扰活性最佳的鸡CEBPA表达载体,该基因在如皋黄鸡各组织中广泛表达,其中以肝脏中相对表达量较高。结果为进一步研究鸡CEBPA的功能提供了参考依据。展开更多
文摘【目的】研究旨在对努比亚山羊大脑富集Ras同源物(Ras homolog enriched in brain,Rheb)基因进行克隆和分析,并构建其真核表达载体,为进一步揭示Rheb对努比亚山羊骨骼肌调控的分子机理奠定基础。【方法】试验采用RT-PCR方法从努比亚山羊背最长肌组织中扩增Rheb基因,经琼脂糖凝胶电泳及测序验证正确后进行生物信息学分析,同时构建该基因真核表达载体,转染细胞后进行实时荧光定量PCR检测来验证所构建载体的正确性。【结果】努比亚山羊Rheb基因编码区序列长度为555 bp,编码184个氨基酸,Rheb蛋白分子式为C 910 H 1456 N 236 O 279 S 6,分子质量为20359.34 u,原子总数为2887,理论等电点为5.93。Rheb蛋白属于稳定的亲水性蛋白,不包含跨膜结构域。蛋白二级结构预测结果显示,努比亚山羊Rheb蛋白中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占40.76%、7.07%、22.83%和29.35%。构建的真核表达载体pcDNA3.1-Rheb转染山羊骨骼肌细胞后,与空载体组相比,Rheb基因表达量极显著升高(P<0.01)。【结论】本试验成功克隆努比亚山羊Rheb基因编码区序列,并构建pcDNA3.1-Rheb真核表达载体,这为深入理解Rheb基因在努比亚山羊肌肉中的作用提供了理论支持。
文摘【目的】试验旨在探究CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,CEBPA)基因在如皋黄鸡中的生物学特征、组织表达水平,并构建其表达载体。【方法】对如皋黄鸡CEBPA基因CDS区进行克隆并测序,与其他物种进行相似性比对及系统进化树构建,通过生物信息学软件对如皋黄鸡CEBPA蛋白的理化性质、磷酸化位点、糖基化位点、功能结构域、互作蛋白及二级结构、三级结构进行预测。利用实时荧光定量PCR技术检测CEBPA基因在如皋黄鸡心脏、肝脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、腺胃、肌肉、睾丸中的表达情况。构建CEBPA基因过表达(OE-CEBPA)和干扰载体(CEBPA-sh12,CEBPA-sh167,CEBPA-sh727),并检测各载体活性。【结果】如皋黄鸡CEBPA基因CDS区序列全长975 bp,共编码324个氨基酸。相似性比对结果显示,如皋黄鸡与日本鹌鹑、鸿雁、野鸽、野鸭的CEBPA氨基酸序列相似性均>94%,其中与日本鹌鹑的相似性最高,达99.4%;系统进化树结果表明,如皋黄鸡与日本鹌鹑的亲缘关系较近,与哺乳动物的亲缘关系较远。如皋黄鸡CEBPA蛋白为亲水不稳定蛋白,存在25个磷酸化位点,含9个N-糖基化位点和109个O-糖基化位点;CEBPA蛋白具有1个转录激活区和1个与DNA结合的亮氨酸拉链结构bZIP;如皋黄鸡CEBPA蛋白二级结构主要由193个无规则卷曲、93个α-螺旋、25个延伸链和13个β-转角组成,三级结构预测结果与二级结构基本一致;CEBPA蛋白主要与TRIB1、PPARG、RXRA、MAPK9、MAPK10、JUN、ESR1等蛋白互作。CEBPA基因在如皋黄鸡各组织中均有表达,其中以肝脏中表达量最高。成功构建CEBPA过表达载体和3个干扰载体,将它们分别转染至鸡成纤维细胞,与对照组相比,过表达组(OE-CEBPA)CEBPA基因表达量显著升高(P<0.05),干扰组(CEBPA-sh167)CEBPA基因表达量显著下降(P<0.05)。【结论】试验获得如皋黄鸡CEBPA基因完整CDS区并成功构建与筛选出具有过表达/干扰活性最佳的鸡CEBPA表达载体,该基因在如皋黄鸡各组织中广泛表达,其中以肝脏中相对表达量较高。结果为进一步研究鸡CEBPA的功能提供了参考依据。
