逍遥散及其拆方对Erastin诱导的LO-2肝细胞系铁死亡的影响

目的 探讨逍遥散及其拆方对Erastin诱导肝细胞铁死亡的影响及机制。方法 使用铁死亡诱导剂Erastin诱导肝细胞LO-2铁死亡,用逍遥散及各功效拆方(逍遥散去疏肝药组、逍遥散去健脾药组、逍遥散去养血药组)的含药血清进行干预,阳性对照药使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1。通过CCK-8检测细胞活力,ELISA法检测细胞上清液中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平,比色法检测细胞中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、Fe^(2+)等含量,荧光酶标仪检测脂质过氧化活性氧(reactive oxygen species,ROS),RT-PCR检测细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、铁调素(hepcidin)、膜铁转运蛋白(ferroportin,FPN1)mRNA表达,Western blot检测细胞中骨形态发生蛋白6(bone morphogenetic protein6,BMP6)、铁调素调节蛋白(hemojuvelin,HJV)、Smad同源物4(mothers against decapentaplegic homolog 4,SMAD4)蛋白表达。结果 erastin诱导肝细胞铁死亡后,细胞活力较对照组显著下降(P<0.05),细胞外上清液中ALT、AST含量显著上升(P<0.05),细胞中MDA、ROS、Fe^(2+)、PTGS2与hepcidin mRNA表达及BMP6/HJV/Smad4信号通路蛋白显著上升(P<0.05),GSH含量及GPX4、FPN1 mRNA表达显著下降(P<0.05)。除逍遥散去养血药组在Smad4蛋白表达方面与模型组无显著差异(P>0.05),逍遥散及各功效拆方及阳性对照药Ferrostatin-1均能显著逆转上述指标的变化(P<0.05)。与整方组疗效比较,逍遥散去疏肝药组AST、MDA、GSH、ROS、Fe^(2+)、BMP6、hepcidin、FPN1指标具有显著差异(P<0.05);除逍遥散去健脾药组在Smad4蛋白表达方面与整方组无显著差异(P>0.05),逍遥散去健脾药组及逍遥散去养血药组对所检测指标均有显著改善(P<0.05)。结论 逍遥散可抑制Erastin诱导的肝细胞铁死亡,其机制可能与调控BMP6/HJV/SMAD4信号通路及其下游hepcidin-ferroportin轴有关,而逍遥散各功效拆方均在一定程度上参与了逍遥散抑制肝细胞铁死亡的过程。

基于TLR/NF-κB信号通路的异功散治疗慢性病贫血的机制研究

目的 探讨异功散通过TLR/NF-κB信号通路治疗慢性病贫血(ACD)的作用及机制。方法 将60只C57BL/6小鼠分为空白组、模型组、异功散(YGS)组、促红细胞生成素(EPO)组,建立酵母多糖诱导的脓毒症(ZIGI)炎性贫血小鼠模型,在酵母聚糖A(Zymosan A)注射后的第5天造模成功,分别连续给药7 d,比较各组小鼠体质量、血红蛋白(Hb)、肝组织铁调素(HAMP) mRNA、铁转运蛋白(Fpn) mRNA水平、脾脏指数及肝脏IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎症因子水平,比较空白组、模型组、YGS组小鼠肝组织TLR4/NF-κB信号通路TLR4、p65、p-p65蛋白以及MD2及CD14mRNA表达。结果 造模成功后,造模小鼠的体质量、Hb均较空白组降低(P<0.01)。给药7 d后,给药小鼠的Hb水平均上升(P<0.01),YGS组体质量升高(P<0.01)。与空白组比较,模型组肝组织HAMP mRNA升高(P<0.01),Fpn mRNA降低(P<0.01);与模型组比较,YGS组、EPO组肝组织HAMP mRNA表达下降(P<0.01),Fpn mRNA水平升高(P<0.01)。与空白组比较,模型组脾脏指数升高(P<0.01),肝组织IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ水平升高(P<0.01);与模型组比较,YGS组脾脏指数降低(P<0.01),肝组织IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ水平降低(P<0.01)。与空白组比较,模型组肝组织TLR4及p65、p-p65蛋白表达增加(P<0.01),MD2、CD14 mRNA表达增加(P<0.01);与模型组比较,YGS组肝组织TLR4及p65、p-p65蛋白表达水平降低(P<0.01),MD2、CD14 mRNA表达减少(P<0.01)。结论 异功散可能通过调节TLR/NF-κB通路,下调IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎症因子水平,进而缩小肿大的脾脏,有效调控hepcidin-ferroportin轴,改善贫血。

铁调素-铁输出蛋白信号通路在腺嘌呤诱导慢性肾脏病大鼠模型中的表达及意义

目的观察腺嘌呤诱导的慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)大鼠模型中铁调素(hepcidin)-铁输出蛋白(ferroportin,FPN)信号通路的表达情况,探讨其参与CKD肾纤维化的作用机制。方法选择20只6周龄雄性无特定病原体级SD大鼠。采用简单随机法将大鼠分成对照组和CKD组,每组各10只。于建模后第2、6周末处死大鼠。分别检测大鼠血清肌酐(serum creatinine,Scr)、血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、24 h尿蛋白定量水平。观察大鼠肾脏病理改变,检测肾组织铁含量、血清hepcidin-25水平、hepcidin基因(HAMP)及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,Col-Ⅰ)、hepcidin、FPN1、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)P65的蛋白及mRNA表达。结果与对照组比较,CKD组大鼠Scr、BUN、24 h尿蛋白定量水平在建模第2周末和第6周末均明显升高(P<0.05)。肾组织染色结果可见,CKD组有明显的肾小球结构紊乱、肾小管扩张以及间质胶原纤维沉积。CKD组大鼠较对照组血清hepcidin-25以及肾组织的铁含量水平明显升高,且相关性分析提示两者均与大鼠肾脏功能呈正相关(P<0.05)。与对照组比较,CKD组建模第2周末、第6周末大鼠肾脏的α-SMA、Col-Ⅰ、HAMP、IL-6、TNF-α、NF-κB P65的蛋白及mRNA表达均增加(P<0.05),而FPN1表达减少(P<0.05)。HAMP的mRNA表达与α-SMA、Col-Ⅰ、IL-6、TNF-α、NF-κB P65呈正相关(P<0.001),与FPN1呈负相关(P<0.001),FPN1的mRNA表达与α-SMA、Col-Ⅰ呈负相关(P<0.001)。结论在腺嘌呤诱导的CKD大鼠模型中可能存在铁死亡,且可能是通过HAMP-FPN信号通路与炎症反应相互作用参与肾纤维化的进程,血hepcidin-25有望成为早期诊断CKD的血清学标志物。