高致病性禽腺病毒血清4型Hexon蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】原核表达禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)Hexon蛋白,并制备兔抗Hexon多克隆抗体,为FAdV-4 Hexon功能研究提供材料。【方法】采用基于PCR的长DNA序列准确合成(PCR-based accurate synthesis,PSA)方法,设计全长拼接引物,在引物两端各设计保护性碱基合成FAdV-4 Hexon基因;利用同源重组技术将其连接至pCzn1-Hexon表达载体,获得pCzn1-Hexon重组质粒进行原核表达,采用纯化重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗Hexon蛋白的多克隆抗体。以间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】重组原核表达质粒pCzn1-Hexon经双酶切及测序鉴定证明构建正确;获得的重组蛋白以包涵体的形式表达,分子质量约为41 ku;用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔后,通过间接ELISA方法检测抗体效价高达1∶512000。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting和IFA检测到鸡肝癌细胞(LMH)中的Hexon蛋白表达,表明制备的多克隆抗体能与Hexon蛋白发生特异性反应。【结论】FAdV-4 Hexon蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,制备并纯化的抗Hexon多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,该研究为进一步探究Hexon蛋白的生物学功能及其在FAdV-4感染和致病过程中的作用奠定了基础。

Ⅰ群禽腺病毒Hexon蛋白的截短表达与鉴定

本研究利用PCR方法扩增出Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠhexon基因主要抗原区,连接于表达载体pGEX-4T-1中,构建成重组质粒pGEX-hexon,并转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达,对表达的Hexon蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果显示,试验成功扩增获得hexon基因主要抗原区序列,大小为1020bp。重组蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白大小为63.1ku,与预测值相符。经Western-blot分析,表明重组蛋白与FAVⅠ的阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性,为FAVⅠ诊断试剂盒的研制奠定基础。

Ⅰ群禽腺病毒Hexon蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与应用

旨在原核表达Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ)的Hexon蛋白,并以Hexon蛋白为包被抗原建立血清的间接ELISA检测方法。将FAVⅠ群Hexon基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组Hexon蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Westernblot鉴定;纯化后的Hexon蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清的间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。结果表明,原核表达获得大小约为37.4ku的重组Hexon蛋白;Westernblot结果表明重组蛋白有良好的特异性和抗原反应性。FAVⅠ间接ELISA法优化反应条件为:抗原最佳包被质量浓度为5.0mg/L,封闭条件为37℃作用1h,血清以1∶200倍稀释作用1h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释作用1h,TMB显色时间为10min。在该优化条件下,OD_(450)≥0.322为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明,对鸡新城疫、禽流感、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对阳性血清的敏感性可达1∶1 200,70份阳性血清的阳性率为97.1%;重复性试验结果表明,批内和批间OD_(450)值的变异系数分别为1.2%~3.5%和5.1%~8.3%;用此方法对临床279份鸡血清样品检测的阳性率为51.3%。表明建立的ELISA检测方法可用于FAVⅠ抗体水平的检测。

鸭源血清4型Ⅰ亚群禽腺病毒Hexon蛋白的原核表达与初步应用

为了获得鸭源血清4型禽腺病毒(FAdV-4)重组Hexon蛋白,并掌握重组蛋白的免疫学活性和应用前景,试验采用PCR方法、原核表达技术、Western-blot检测和间接ELISA方法对鸭源FAdV-4 Hexon蛋白的主要抗原区域进行截短表达、鉴定与初步应用研究。结果表明:PCR方法扩增得到大小为1 011 bp的FAdV-4 Hexon主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导获得以包涵体形式表达的重组蛋白;重组蛋白变性纯化后进行Western-blot检测,其可与FAdV-4阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫学活性;以纯化蛋白为包被抗原,初步建立检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法,用该方法进行检测,FAdV-4灭活疫苗免疫鸭场的免疫合格率为96.46%,FAdV-4感染鸭场的阳性感染率为99.46%,无FAdV-4免疫史和感染史鸭场的阳性感染率为0。说明试验获得了具有良好生物学活性的FAdV-4 Hexon重组蛋白。

鸡腺病毒HZBL-S1株Hexon蛋白基因序列测定与遗传进化分析

为了解广东省禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)HZBL-S1株遗传进化情况,试验对HZBL-S1株六邻体(Hexon)蛋白全基因进行PCR扩增、克隆和序列测定,并对其进行蛋白全基因序列及其氨基酸推导序列的遗传进化分析。结果表明:HZBL-S1株与来自国内外的FAdV基因C型、血清型为4型的参考株的相似性较高,核苷酸(推导的氨基酸)序列的相似性为98.2%~99.9%(98.5%~99.9%)。对Hexon蛋白全基因核苷酸序列及其氨基酸推导序列进行遗传进化分析,HZBL-S1株与基因型为A、B、D、E型的参考株均处于进化树的不同分支,遗传距离相对较远;而与基因型为C型、血清型为4型的参考株均处于进化树的同一分支,遗传距离相对较近。说明HZBL-S1株与基因型为C型的参考株来自同一祖先,推测该病原有可能由国外经某种途径传入我国。

贵州蛋鸡源高致病性FAdV-4分离株Hexon蛋白多克隆抗体的制备

为制备反应原性良好的血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)血清学诊断抗原,本试验从在鸡肝癌细胞(LMH)上接种培养的蛋鸡源高致病性FAdV-4分离株中扩增到Hexon基因,利用同源重组技术将它连接至载体pET-30a,获得重组质粒pET-30a-Hexon,又将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalac toside,IPTG)诱导表达后纯化Hexon蛋白,进一步采用纯化后重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗Hexon蛋白的多克隆抗体。结果显示,重组原核表达质粒pET-30a-Hexon经电泳和测序鉴定证明构建正确;重组蛋白Hexon以包涵体的形式被成功表达,分子质量约37 ku;以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western-blot和间接免疫荧光(indirected immunofluorescence assay,IFA)检测到LMH中的Hexon蛋白表达,表明制备的多克隆抗体能与Hexon蛋白发生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫原性;经间接ELISA测定,抗体效价为1∶2048000。本研究为建立FAdV-4血清学诊断技术、防控该疾病、摸索Hexon蛋白在致病过程中的作用及研制亚单位疫苗等奠定了基础。

鸽源禽腺病毒XY20株Hexon全基因克隆与序列分析

为了明确鸽源禽腺病毒主要致病性相关基因的分子特征,试验对Hexon基因分段进行PCR扩增,并在测序后拼接为完整的XY20株Hexon基因,通过DNAStar 7.1软件将其与从GenBank中选择的49株参考毒株的核苷酸和氨基酸进行序列比对,绘制系统进化树,分析氨基酸位点变异情况;通过SOPMA在线软件预测分析Hexon基因编码的Hexon蛋白的二级结构,通过http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/程序预测Hexon蛋白的N-糖基化位点。结果表明:XY20株Hexon基因序列全长为2814 bp,编码937个氨基酸;XY20株属于C群FAdV-4型,与各群代表毒株Hexon基因的核苷酸相似性在71.7%~100%之间,推导氨基酸序列相似性在76.8%~100%之间,与我国近几年禽腺病毒流行毒株GX-1、HB1510、HLJ 160826等的Hexon基因相似性为100%。与国外C群FAdV-4型毒株相比,XY20株的氨基酸中存在31个变异位点。XY20株Hexon蛋白的二级结构及11个N-糖基化位点与FAdV-4型早期毒株ON1相比没有发生明显变化。说明XY20株与早期FAdV-4型毒株Hexon蛋白抗原性一致,且极有可能源自鸡群FAdV-4型流行毒株。

小鼠抗人腺病毒55型六邻体(HAdV55 Hexon)蛋白单克隆抗体的制备

目的制备特异性小鼠抗人腺病毒55型六邻体蛋白(HAdV55 Hexon)单克隆抗体(mAb)。方法以化学合成HAdV 55、3、4、7、16、21的Hexon基因为模板,PCR扩增后分别构建原核表达质粒pET28a-HAdV55 Hexon与真核表达质粒pCAGGS-HAdV3、4、7、16、21、55 Hexon;将pET28a-HAdV55 Hexon质粒转化至大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,将纯化的包涵体经过变性与复性后利用切向流膜过滤系统获得纯化蛋白;将pCAGGS-HAdV55 Hexon用于拔罐免疫BALB/c小鼠,HAdV55 Hexon蛋白用于加强免疫,通过杂交瘤技术制备抗HAdV55 Hexon的mAb,并进行抗体效价测定、抗体亚类鉴定;对上述抗体利用pCAGGS-HAdV55 Hexon转染HEK293T细胞和BHK细胞分别进行Western blot法和免疫荧光法(IFA)以鉴定其特异性;选择其中效价高的两株抗体,进一步利用pCAGGS-HAdV3、4、7、16、21、55 Hexon转染细胞分别进行Western blot法和IFA做交叉反应性分析。结果成功构建pET28a-HAdV55 Hexon和pCAGGS-HAdV55 Hexon、3、4、7、16、21表达质粒;IPTG诱导pET28a-HAdV55 Hexon转化的BL21细菌,HAdV55 Hexon蛋白主要以包涵体形式表达,经过变性及复性后超滤得到纯化的HAdV55 Hexon蛋白;筛选得到6株可分泌HAdV55 Hexon mAb的杂交瘤细胞株,抗体亚类分析显示2株为IgG2a亚型,4株为IgG2b;获得与HAdV3 Hexon、HAdV4 Hexon、HAdV7 Hexon、HAdV16 Hexon、HAdV21 Hexon无交叉反应性的2株高效价的特异性HAdV55 Hexon抗体。结论获得的特异性小鼠抗HAdV55 Hexon的mAb为建立其抗原检测方法提供了实验基础。

鸡腺病毒血清4型Hexon蛋白的表达及与不同血清型抗体的交叉反应性评价

自2015年我国鸡群大面积暴发肝炎-心包积水综合征以来,我国鸡群鸡腺病毒流行呈现多血清型的复杂情况,甚至同一鸡群有多种血清型鸡腺病毒同时存在,其中鸡腺病毒血清4型(FAdV-4)对鸡的致病性最强。为了解FAdV-4衣壳蛋白Hexon蛋白与其他血清型鸡腺病毒抗体之间的交叉反应性,本研究将FAdV-4 HN/151025毒株的Hexon基因进行分段表达,表达蛋白分别位于CH1(1~370 aa)、CH2(371~671aa)和CH3(672~937 aa)片段。将FAdV-4 HN/151025毒株的Hexon基因的3段表达产物分别与FAdV-4、FAdV-1、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11型抗血清进行Western-blot反应。结果显示,FAdV-4 Hexon蛋白与不同血清型抗体之间均有交叉反应,但不同片段的交叉反应强度有所差异。FAdV-1型血清可与FAdV-4Hexon蛋白CH1和CH2片段发生反应,说明FAdV-4 Hexon蛋白的1~671 aa与FAdV-1型血清有交叉反应。FAdV-8a和FAdV-8b型血清仅与FAdV-4 Hexon蛋白CH2片段发生反应,说明FAdV-8a和FAdV-8b型血清与FAdV-4 Hexon蛋白的交叉反应区域在371~671 aa内。FAdV-11型血清可与FAdV-4 Hexon蛋白的3个片段发生反应,提示FAdV-11与FAdV-4型之间有交叉保护。血清4型FAdV的Hexon蛋白与不同血清型FAdV抗体间的交叉反应及其主要反应区域的研究,将对不同血清型FAdV疫苗的研制及不同血清型FAdV鉴别诊断提供依据。

4株禽腺病毒hexon基因片段序列分析

[目的]验证购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(China Veterinary Culture Collection Center,CVCC)的4株禽腺病毒(FAdV-1 AV208、FAdV-4 AV211、FAdV-8 AV215、FAdV-11 AV218)的血清型。[方法]采用PCR的方法对4株FAdV hexon基因片段进行特异性扩增、克隆与测序,并与GenBank上公布的FAdV各血清型进行亲缘性分析。[结果]hexon基因片段核苷酸及其编码Hexon蛋白氨基酸亲源性分析结果表明,FAdV-1 AV208为禽腺病毒A血清1型;FAdV-4 AV211为禽腺病毒C中的血清4型;FAdV-8 AV215为禽腺病毒E中的血清8b型;FAdV-11 AV218为禽腺病毒C中的血清10型。[结论]FAdV-1 AV208、FAdV-4 AV211的血清型与CVCC标注一致;FAdV-8 AV215为FAdV-8b,相比CVCC该研究进一步细化了其血清型;而FAdV-11 AV218为FAdV-10,与CVCC标注的血清型不一致。该研究为今后正确使用CVCC标准毒株FAdV-8 AV215、FAdV-11 AV218提供了参考。

4型禽腺病毒抗体间接hexon-ELISA检测方法的建立

以4型禽腺病毒(FAdV-4)的DNA为模板,扩增其六邻体(hexon)部分基因并进行重组表达,以重组hexon蛋白为包被抗原,优化ELISA检测条件,建立了FAdV-4的ELISA抗体检测方法。该方法对FAdV-4阳性血清检测为阳性,对于其他鸡常见病毒,如禽流感病毒5、7、9型,新城疫病毒以及鸡传染性支气管炎病毒阳性血清检测均为阴性;与PCR方法的阳性符合率为83.3%。试验表明,建立的以重组hexon蛋白为包被抗原检测FAdV-4血清抗体的ELISA方法可以用于检测FAdV-4的感染及相关流行病学调查。

禽腺病毒4型hexon基因克隆与原核表达分析

应用PCR方法扩增禽腺病毒4型(Fowl adenovirus 4,FAd V-4) Hexon基因,将其克隆至原核表达载体p QE1中,获得重组质粒p QE1-hexon。将重组质粒经诱导表达后,通过SDS-PAGE对表达产物进行分析。结果,Hexon蛋白在25℃经诱导4 h、IPTG浓度为0. 8 mmol/L时可获得最大诱导表达量,表达蛋白的相对分子质量约为107 k D,主要以不溶性包涵体形式存在。纯化复性后,可得到浓度为5. 165 mg/m L及纯度为97%的Hexon蛋白。本研究获得的重组菌p QE1-hexon以及高纯度的Hexon蛋白,为进一步研究FAd V-4检测方法和新型疫苗奠定了基础。

肉桂醛抗腺病毒作用研究

目的:研究肉桂醛抗腺病毒(ADV)作用。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法和病毒增殖抑制实验观测肉桂醛抗ADV作用;免疫荧光法检测肉桂醛对ADV六邻体(hexon)蛋白表达的影响。结果:(1)MTT和病毒增殖抑制实验结果表明肉桂醛在3种作用方式(除细胞保护作用方式)下能够增强宿主细胞存活率,降低病毒滴度,且细胞存活率与药物浓度呈正相关,肉桂醛对宿主细胞无保护作用,不能阻断病毒进入细胞。(2)肉桂醛(除细胞保护作用方式)组与病毒组比较hexon蛋白的表达明显降低(P<0.05)。结论:肉桂醛有抗ADV作用,但却对宿主细胞无保护作用,肉桂醛抗ADV作用可能与调节hexon蛋白的表达有关。

Ⅰ群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

利用纯化的 Ⅰ 群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了 Ⅰ 群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法.结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/mL;最佳封闭液为1% 牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60 min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60 min;最佳显色时间为10 min.用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测.