hhlim基因表达产物的亚细胞定位及其在细胞肥大中的意义

hhlim是从胎儿心脏中新近分离和克隆得到的与心脏发生相关的基因 ,其表达产物作为转录因子参与多种基因的转录调控和细胞的发育与分化过程 .用细胞转染方法将外源性hhlim基因导入处于分化过程中的小鼠成肌细胞C2C12 ,发现该基因强制性表达可使C2C12细胞体积明显增大 .RT PCR和蛋白质印迹结果表明 ,hhlim促细胞肥大与诱导α 肌动蛋白 (α actin)过表达及重新启动胚胎基因BNP表达有关 .用绿色荧光蛋白 hhlim融合蛋白表达载体转染处于分化过程的C2C12细胞 ,发现转染不同时间 ,表达产物的亚细胞定位发生动态变化 ,表现为先在胞核和胞质中均有分布 ,而后定位于胞质的变化规律 .应用免疫共沉淀证实 ,hhlim在胞质中以与α actin相互缔合的方式存在 .

hhlim基因转录调控区域鉴定及表达调控的初步研究

为了研究hhlim基因表达调控机制 ,对该基因 5′上游 - 2 5 37bp序列从 5′端依次进行缺失后 ,利用荧光素酶报告基因检测各种不同长度片段在C2C12细胞中驱动荧光素酶表达的活性 .结果表明 ,在hhlim基因 5′上游- 2 5 37～ - 15 37bp之间存在负调控元件 ,在 - 2 5 3～ - 15 7bp之间含有增强子样序列 .用含有增强子样序列的DNA片段做探针 ,对未分化型和分化型C2C12细胞的核蛋白进行电泳迁移率改变分析 (electrophoreticmopilityshiftassay ,EMSA) .分析的结果显示 ,两种表型细胞中的核蛋白与探针结合所形成滞后带的谱型明显不同 .结果还发现内皮素 1(ET 1)和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)既能显著诱导C2C12细胞对hhlim的表达 ,也能刺激含增强子样序列的调控区域所驱动的报告基因表达 .提示hhlim基因转录起始点至 - 2 5 37bp的区域内含有负调控元件及增强子样序列 ,该基因的表达受ET

细胞肥大过程中hhLIM的亚细胞定位变化及其对细胞骨架的影响

hhlim (humanheartlim)是从人胎心cDNA文库中筛选克隆的一个新基因 ,作为LIM家族的新成员参与心肌肥大的发生发展过程 .为了进一步研究hhLIM在心肌肥大发生过程中的作用 ,以C2C12细胞为研究对象 ,以心肌肥大强效刺激因子内皮素 1(ET 1)为诱导因素 ,探讨hhLIM与肌动蛋白的相互作用及其影响细胞骨架的分子机制 .RT PCR、Western印迹和细胞免疫荧光分析结果表明 ,心肌肥大刺激因子ET 1在诱导心肌肥大标志基因BNP和肌动蛋白表达的同时 ,使hhLIM蛋白在C2C12细胞胞核与胞质之间进行重新定位 .激光共聚焦显微镜观察结果显示 ,hhLIM与肌动蛋白在胞质中共定位 .蛋白分步提取、鉴定及hhLIM与F肌动蛋白结合与沉降实验证明 ,hhLIM多存在于细胞骨架及其相关蛋白部分 ,在体外可与F肌动蛋白共结合 .这些结果表明 ,胞质中的hhLIM作为细胞骨架相关蛋白与肌动蛋白相互作用 .进一步研究hhLIM与细胞骨架的关系时发现 ,hhLIM过表达可使C2C12细胞的骨架变成致密网状纤维并使其对细胞松弛素导致的细胞骨架解聚产生一定的抵抗作用 ,抑制hhLIM表达则使细胞骨架稀疏 ,结构模糊 .提示hhLIM参与细胞骨架组织及重构的机制与其结合并稳定F肌动蛋白有关 .

hhlim促进DMSO诱导的P19细胞向心肌分化

为了确定hhlim是否参与胚胎期的心肌分化和发育过程 ,用可表达hhlim蛋白和hhlim反义RNA的真核表达质粒转染P19胚胎干细胞 ,经G4 18筛选得到稳定表达hhlim和hhlim反义RNA的P19细胞克隆后 ,观察hhlim对P19细胞向心肌分化和发育的影响 .结果显示 ,Nkx2 5和GATA 4在未被外源性hhlim基因转染的P19细胞中不表达 .DMSO刺激细胞 2天后 ,GATA 4开始表达 ,3天后Nkx2 5的表达活性显著升高 .hhlim的过表达不但有利于P19细胞的存活和生长 ,而且还可以使Nkx2 5和GATA 4的表达比对照细胞提前 1天 .反义hhlim细胞株被DMSO诱导 5天后 ,细胞仍呈集落化生长 .同时 ,Nkx2 5和GATA 4开始表达的时间明显延滞 .结果表明 ,hhlim能促进P19细胞向心肌细胞分化 ,其作用是通过促进转录因子GATA 4和Nkx2