香石竹斑驳病毒属简并引物RT-PCR检测方法的建立

【目的】使用简并引物RT-PCR方法并结合序列测定与分析,为甲型香石竹斑驳病毒属(Alphacarmovirus)、乙型香石竹斑驳病毒属(Betacarmovirus)和丙型香石竹斑驳病毒属(Gammacarmovirus)病毒建立一种快速、灵敏、广谱的检测鉴定方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析,在依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因的保守区域设计1对简并引物Carmo-F2/Carmo-R2,在引物5′端分别加入非互补的富含AT序列(AATAAATCATAA)形成引物Carmo-F2a/Carmo-R2a,测试简并引物RT-PCR方法的广谱性、特异性和灵敏度,并对PCR产物进行测序、序列分析和系统发育分析。利用该方法对来自厦门的扶桑(Hibiscusrosa-sinensis)样品进行病毒检测。【结果】利用Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a两对引物建立的RT-PCR方法,扩增甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的部分RdRp基因,扩增片段分别约为500和550 bp。该方法成功用于检测甲型香石竹斑驳病毒属的香彩雀花碎色病毒(angelonia flower break virus,AnFBV)、小花矮牵牛斑驳病毒(calibrachoa mottle virus,CbMV)、香石竹斑驳病毒(carnation mottle virus,CarMV)、天竺葵花碎色病毒(pelargonium flower break virus,PFBV),乙型香石竹斑驳病毒属的木槿褪绿环斑病毒(hibiscus chlorotic ringspot virus,HCRSV),丙型香石竹斑驳病毒属的甜瓜坏死斑点病毒(melon necrotic spot virus,MNSV),显示出良好的广谱性。特异性检测表明,简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a在玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus,MCMV;Machlomovirus)、天竺葵线纹病毒(pelargonium line pattern virus,PLPV;Pelarspovirus)、香石竹环斑病毒(carnation ringspot virus,CRSV;Dianthovirus),健康的西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆植物未扩增到预期大小的条带。灵敏度检测表明,简并引物Carmo-F2/Carmo-R2最低可检测到10-2稀释液,简并引物Carmo-F2a/Carmo-R2a可检测到10-3稀释液,在5′端加入非互补的富含AT序列可以提高简并引物RT-PCR检测方法的灵敏度。BLAST分析表明,测定的序列均与相应病毒种类具有最高序列一致性。部分RdRp基因氨基酸序列的系统发育分析结果符合目前通读病毒亚科(Procedovirinae)病毒的分类情况,且可以把病毒鉴定到种的水平。采集13份疑似病毒症状的扶桑样品,均检出木槿褪绿环斑病毒。【结论】基于简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a的RT-PCR方法,可用于甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的筛查检测,结合序列分析及系统发育分析可进行病毒种类的快速鉴定,并有助于发现新的病毒种类。厦门扶桑植物受到木槿褪绿环斑病毒的侵染。