靶向抗TIGIT和PVRIG双特异抗体的制备及体外生物性活性的研究

目的制备靶向抗T细胞免疫球蛋白-ITIM结构域蛋白(T cell immune receptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)和脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域蛋白(Poliovirus receptor-related immunoglobin domain-containing protein,PVRIG)双特异抗体,探究其体外生物学活性。方法用PVRIG人源化抗体hP1和TIGIT人源化抗体hT1构建KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体,将纯化得到KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳、热稳定性检测和稳定性分析;采用流式细胞术(Fluorescence activated cell sorting,FACS)检测双特异性抗体的结合活性;采用生物干涉膜技术(Bio-layer interferometry,BLI)检测双特异性抗体亲和力;用Jurkat-NFAT-Luc2-PD1-TIGIT-PVRIG细胞和293T-OS8-PVRL2-PDL1细胞中检测双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV对于TIGIT/PVRIG靶点的阻断作用;采用CMV recall assay法检测IFN-r在上清液中的浓度。结果SDS-PAGE凝胶电泳结果显示KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体纯度>95%;Tm结果为Tm1:66.34,Tm2:80.95。采用SEC-HPLC对双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV进行稳定性分析,其纯度均>90%。KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和PVRIG的人源化抗体hP1与293T-PVRIG cell line的EC 50分别为0.16870μg/mL和0.03865μg/mL,与293T-cyno-PVRIG cell line的EC 50分别为0.03714μg/mL和0.03198μg/mL,与Human PVRIG Protein,His Tag的亲和力为1.74E-10M和1.69E-10M。KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和TIGIT的人源化抗体hT1与293T-PVRIG cell line的EC 50分别为0.07027μg/mL和0.03121μg/mL;与293T-cyno-TIGIT cell line的EC 50分别为0.02028μg/mL和0.02822μg/mL;与Human TIGIT Protein,His Tag的亲和力为8.50E-10M和8.47E-10M。KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有阻断PD1/PDL1/TIGIT/PVRIG相互作用活性,且KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV的EC 50为0.007μg/mL,优于单独人源化抗体hT1(EC 50为0.013μg/mL)和hP1(EC 50为0.048μg/mL)的作用。在含pp65 peptide条件下KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体分泌IFN-r为349.72 pg/mL,明显高于其他抗体。结论KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有高亲和力和良好的生物学活性,有望开发成为肿瘤免疫治疗的抗体药物。

IgE高亲和力受体β链基因与中国湖北成人变应性哮喘的关系

目的 :探讨IgE高亲和力受体 β链基因 (FcεRⅠβ)启动子 - 10 9位和编码区Glu2 37Gly基因多态性与湖北成人变应性哮喘及血浆总IgE的关系。方法 :采用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性技术检测FcεRⅠβ基因启动子区 - 10 9位和编码区Glu2 37Gly两位点多态性 ,采用病例 -对照法共研究 10 6例成人变应性哮喘患者和 10 6例相匹配的对照者。结果 :①成人变应性哮喘患者FcεRⅠβ基因启动子区 - 10 9位T/T、T/C和C/C基因型频率是0 4 15、0 4 91和 0 0 94 ;与对照相比差异无显著 (χ2 =0 5 5 75 ,P >0 0 5 ) ,但成人变应性哮喘组T/T基因型患者血浆总IgE对数值为 2 6 4 90± 0 92 4 1与T/C基因型的 2 2 96 0± 1 10 4 0和C/C基因型的 2 3130± 0 80 5 2相比差异显著。②FcεRⅠβGlu2 37Gly位点Glu/Glu、Glu/Gly和Gly/Gly基因型频率为 0 5 6 6、0 377和 0 0 5 7,与正常对照相比差异显著 (χ2=7 31,P <0 0 5 ) ,Gly/Gly基因型血浆总IgE对数值为 2 72 2 0± 0 9374 ,与Glu/Glu和Glu/Gly相比差异显著。结论 :IgE高亲和力受体 β链启动区 - 10 9位T/T基因型与血浆总IgE高度相关 ,编码区 2

儿童哮喘IgE高亲和力受体β链基因多态性分析

目的研究儿童哮喘IgE高亲和力受体β链(FcεRI-β)基因多态性.方法采用扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(ARMS-PCR)技术对151例哮喘儿童和105例健康对照儿童进行Fc ε RI-β基因第6外显子区I181L、V183L和第7外显子区E237G位点的多态性检测,分析其与儿童哮喘易感性的关系,并用酶免法检测血清总IgE水平及过敏原表型,研究上述3个编码区的基因型与表型的关系.结果 I181L突变与儿童哮喘有显著相关性(OR=2.00,95%CI=1.10～3.11),哮喘儿童及健康对照儿童均不存在V183L突变或突变率极低,E237G突变与儿童哮喘无显著相关性;I181L及E237G突变均与过敏原或血清总IgE水平增高无关.结论 FcεRI-β I181L基因突变是我国长春地区儿童哮喘的易感基因,但无足够证据证明FcεRI-β基因是儿童哮喘特应性的决定性基因.

IgE及其可溶性高亲和力受体α链与慢性荨麻疹的相关性分析

目的测定慢性荨麻疹(CU)患者血清IgE及其可溶性高亲和力受体α链(sFcεRIα)的水平,了解CU与IgE及其受体的相关性。方法分别采用酶联免疫吸附试验、免疫散射比浊法和免疫印迹法测定99例门诊CU患者(CU组)和88名无过敏史的健康者(对照组)的血清sFcεRIα和IgE水平、过敏原、皮肤划痕试验结果,比较两组间的差异,分析CU患者血清sFcεRIα水平与临床资料之间的相关性。结果 CU组的血清sFcεRIα和IgE水平均显著高于对照组(P值分别<0.01、0.05)。CU患者的血清sFcεRIα与IgE水平呈负相关(r=-0.29,P=0.03)。过敏原与血清sFcεRIα和IgE水平均相关(r=0.624、0.332,P=3.74×10-8、0.043)。CU患者的血清sFcεRIα和IgE水平与皮肤瘙痒、风团数量和大小的评分总和,以及与病程、年龄和性别均不相关(P值均>0.05)。高水平sFcεRIα(>4.974μg/mL)患者皮肤划痕试验的阳性率达95.2%(20/21)。结论血清sFcεRIα和IgE水平与CU相关,CU患者的血清sFcεRIα与IgE水平呈负相关。

高亲和力IgE受体介导的信号传导及其相关的抑制性受体

作者介绍了高亲和力IgE受体介导I型超敏反应,其活化后的信号传导通路,及其相关的抑制性受体方面的研究进展,包括FcγRIIβ、PIR B、SIRPα、CD81及MAFA。对高亲和力IgE受体介导的信号通路和其相关的抑制性受体的研究将有可能发现对抗Ⅰ型超敏反应的新靶点,从而有助于过敏相关疾病的治疗。

高亲和力IgE受体α链cDNA的克隆及序列测定

目的 :为获得编码高亲和力IgE受体(FcεR1)α链的cDNA序列。方法 :从正常人外周血中富集嗜碱性粒细胞 ,提总RNA进行RT PCR ,分子克隆 ,用自动测序及放射自显影测序。结果 :分离并鉴定了该cDNA重组子 ,在159密码子及185密码子分别发现了CAC→CGC与TAT→CAT置换。结论 :建立了一个编码FcεR1膜外区α链的cDNA重组子克隆 ,它不含引导肽序列 ,可能是一个来自中国人的该基因的变异体。

哮喘儿童IgE高亲合力受体β链基因多态性的初步研究

目的探讨IgE高亲合力受体β链基因的I181L,V183L和E237G位点基因多态性与儿童哮喘及血浆总IgE的关系。方法采用扩增阻滞突变系统聚合酶链式反应(ARMS-PCR)检测技术对50例四川地区哮喘儿童和40例健康对照儿童进行181,183,237三个位点的多态性进行检测,并用双抗体夹心ELISA法检测血清总IgE水平,分析其与儿童哮喘易感性的关系。结果在哮喘儿童中检测到I181L突变5例、V183L突变2例、E237G突变7例,在对照组中未发现突变子;有突变的哮喘儿童的血清IgE明显高于无突变和正常对照儿童。I181L和E237G突变与儿童哮喘和血清IgE升高有显著相关性。结论FcεR1β基因I181L和E237G基因多态性是儿童哮喘发病的重要候选基因,与血清总IgE水平升高密切相关。

IgE的新作用

IgE为经典过敏反应中抗原与主要效应细胞即肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合的桥梁。当IgE与FcεRⅠ结合时,效应细胞上的IgEFc受体及少量抗原便足以触发信号通路活化,引起效应细胞脱颗粒。过敏反应不仅受IgE单独调节,也受跨膜、可溶性IgE受体及一些共受体组成的复杂蛋白网络的调控。IgE不仅参与过敏性疾病,还与自身免疫病等多种疾病存在密切联系,其中针对自身抗原的IgE型自身抗体的作用机制备受关注。本文我们聚焦新近发现的IgE的生物学功能、IgE及其受体细胞在疾病中的作用及相关疾病的诊疗方法。

人FcεRIα亚基细胞外区的原核表达及其和IgE结合的机制

应用两种不同的表达系统对FceR I α亚基的细胞外区进行克隆和表达,表达产物经纯化后用免疫斑点杂交法检测其与IgE结合的能力,探索IgE与其高亲和力受体FceR I α亚基的细胞外区结合的机制。结果两种体系均成功表达出FceRI α亚基的细胞外区,pBAD/gⅢA表达的FceR I α亚基的细胞外区能与IgE结合,而PQE30表达的FeaR I α亚基的细胞外区不能与IgE结合。提示FccR I α亚基的细胞外区已足够和IgE结合,无需β、γ亚基的存在,其所具有的一定的空间构型和二硫键的形成在与IgE结合时是必需的,而糖基化位点在与IgE的结合时是非必需的。

高亲和度IgE受体β链基因多态性与过敏性哮喘相关性的研究

目的 :检测FcepsilonRI-beta三个突变位点I181L ,V183L和E2 37G在中国南方汉族人群中的存在和频率分布 ;判断这些突变与哮喘及特应症的相关性。方法 :利用扩增阻滞突变系统聚合酶链技术 (ARMS -PCR)对 6 0例哮喘患者FcepsilonRI -beta基因编码 181,183和 2 37的三个氨基酸位点进行分析和检测 ,并与 6 5例正常人进行对照。结果 :在哮喘组中检测到 1例I181L杂合子 ,被检人群中没有发现V183L突变。Glu2 37/Cly2 37在哮喘人群中的频率是 18.3% ,E2 37G突变基因频率为 9.2 % ;Glu2 37/Cly2 37在特应性哮喘人群中的频率是 2 2 .6 %E2 37G突变的基因频率为 11.3% ,Glu2 37/Gly2 37在正常对照人群中的频率是 6 .2 %E2 37G突变的基因频率为 3.1%。结论 :在中国南方汉族人群中存在E2 37G突变。不存在V183L突变或突变率很低。E2 37G突变与哮喘有相关性 (P <0 .0 5OR =3.18) ;E2 37G突变与特应症有相关性 (P <0 .0 2 5OR=4 .0 0 ) ,I181L突变的存在不确定。

高亲和力IgE受体β链基因与儿童哮喘的相关性研究

目的研究FcεRⅠ-β的I181L、V183L和E237G突变在四川地区11岁以下汉族儿童中的存在和频率,判断这些突变与儿童哮喘的相关性。方法利用扩增阻滞突变系统聚合酶链技术(ARMS-PCR)对四川地区的48例汉族哮喘儿童进行FcεRⅠ-β的1811、83、237三个位点的突变进行检测和分析,并与40例健康儿童进行对照。结果在哮喘组中检测到I 181L突变5例(10.4%),V 183L突变2例(4.2%),E 237G突变6例(12.5%),在对照组中未发现I 181L、V 183L、E 237G突变子。结论四川地区汉族儿童中存在I 181L、E 237G突变,不存在V 183L突变或突变率极低。I 181L突变与哮喘存在相关性(P<0.05),E 237G突变和哮喘有相关性(P<0.025),而V 183L与哮喘不存在相关性(P>0.05)。

支气管哮喘患者β_2-肾上腺素能受体基因多态性与血清总IgE关系的研究

目的探讨支气管哮喘患者 β2 肾上腺素能受体 (β2 AR) 16、2 7位点基因多态性与血清总IgE的相关性。方法采用等位基因特异性聚合酶链反应 (AS PCR)方法 ,对 4 4例支气管哮喘患者进行 β2 AR基因多态性分析 ,并测定其血清总IgE。结果各基因型血清总IgE的值 ,16位点 :精氨酸 /精氨酸为 5 2 5 2 5± 2 2 0 73mmol/L ,甘氨酸 /精氨酸为 4 19 87± 2 6 4 0 8mmol/L ,甘氨酸 /甘氨酸为 5 35 10±2 89 5 1mmol/L ,三者比较差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;2 7位点 :谷氨酰胺 /谷氨酰胺为 75 6 13±2 2 0 6 3mmol/L ,谷氨酸 /谷氨酰胺为 341 0 0± 136 6 6mmol/L ,谷氨酸 /谷氨酸为 4 2 5 33± 2 74 13mmol/L ;三者比较差异有显著性 (P <0 0 1)。结论 β2 AR基因 2 7位点多态性与血清总IgE相关联。

重组可溶性IgE受体对小鼠被动皮肤过敏反应的抑制效应

目的:观察重组可溶性IgE受体对I型超敏反应的抑制作用。方法:用卵清蛋白(OVA)作抗原制备抗血清,在动物小鼠身上复制被动皮肤过敏反应模型,以非相关蛋白αtp0为对照,观测自行制备的重组可溶性IgE受体αtp2对其反应的抑制作用。结果:ELISA试验证实,αtp2可竞争性地与IgE受体结合;被动皮肤过敏反应试验中,10μgαtp2对风团的抑制作用为12%。20μg对风团的抑制作用为19%,后者与生理盐水组比较有明显差异(P<0.05)。结论:我们研制的重组可溶性IgE受体αtp2,可竞争性地与IgE结合,被动皮肤过敏试验中,αtp2对风团的大小有明显的抑制作用,但未能彻底抑制风团的形成。

哮喘人群中IgE低亲和力受体基因多态性检测

目的:探讨IgE低亲和力受体(FeaRⅡ,CD23)基因点多态性与哮喘易感性的关系。方法:聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测外显子9上的G→A碱基突变。结果:本实验未能发现基因外显子9上存在G→A突变, PAGE电泳检测不到限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)。结论:所研究人群中FceRⅡ基因不存在(G→A)点多态性。

人高亲和力IgE受体α链基因克隆及表达

目的:克隆人高亲和力IgE受体α链基因,并进行原核表达,制备出可溶性FcεRIα蛋白。方法:应用RT-PCR技术,从皮肤组织的总RNA中扩增人高亲和力IgE受体α链基因,连接至PUCm-T载体,重组克隆进行DNA测序。将测序证实的目的片段与高效表达载体pET30a连接,构建重组质粒并转入表达宿主菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化。结果:RT-PCR扩增出一个约950bp的DNA片段,测序结果显示该片段与GenBank上登录的FcεRIα基因序列完全一致;经原核表达后,获得相对分子质量37000的FcεRIα融合蛋白。结论:本实验成功克隆、表达了人FcεRIα基因,制备出可溶性FcεRIα蛋白,为抗FcεRIα抗体的检测及自身免疫性慢性荨麻疹发病机制的研究提供了条件。

龙牡汤对特应性皮炎小鼠树突状细胞IgE高亲和力受体γ亚基启动子甲基化水平及Th分化的影响

目的探讨自拟方龙牡汤对特应性皮炎(AD)小鼠树突状细胞(BMDC)IgE高亲和力受体(high affinity IgE receptor,FcERI)γ亚基启动子甲基化水平以及对Th2型免疫反应的影响。方法将30只BALB/c小鼠分成模型组、中药组、空白组,各10只。将模型组、中药组共20只小鼠制作AD模型,中药组给予龙牡汤灌胃,模型组、空白组给予浓度0.9%生理盐水灌胃,均1次/d,连续灌胃3周。将各组小鼠常规脱颈椎处死,取股骨和胫骨,分离并培养BMDC;中药组、模型组小鼠处死后,立刻经腹主动脉采血,分离血清,分别配成10%含龙牡汤血清和10%非含药血清。将BMDC随机分为对照组与给药组,对照组加入10%非含药血清,给药组加入10%含龙牡汤血清继续培养48 h。用流式细胞术检测BMDC的CD11c阳性率,用Western blotting法检测BMDC细胞FCER1γ蛋白表达,甲基化特异性PCR(MSP)检测,ELISA法检测BMDC细胞培养液上清中MCP-1、IL-12水平;流式细胞术检测BMDC细胞培养液CD4、IL-4双阳性率。结果与对照组比较,中药组BMDC细胞FCER1γ蛋白表达低(P<0.05);含药血清组FCER1γ亚基启动子甲基化水平高于对照组(P<0.05);中药组比对照组MPC-1水平低,IL-12水平高(P<0.05);与空白组比较,中药组的CD4和IL-4双阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论龙牡汤能够提高AD小鼠突状细胞FcERⅠγ亚基基因调节序列甲基化水平,进而抑制FcERⅠγ亚基与FcERⅠ在细胞表面过度表达,促进了Th1分化,抑制了Th2型免疫反应。

过敏性儿童白细胞介素4受体Q576R与血清总IgE相关性探讨

目的探讨过敏性儿童白细胞介素4（IL-4）受体Q576R与血清总IgE的关系。方法采用聚合酶链反应（PCR）和垂直电泳方法，检测80例患过敏性疾病的儿童和20例正常对照儿童IL-4R是否存在Q576R突变位点，并用测序进行确认。采用日本HITACHI的CLA-1过敏原分析仪检测80例患过敏性疾病的儿童和20例正常对照组儿童血清总IgE水平，然后进行X^2检验及成组t检验。结果IL-4受体Q576R突变位点和血清总IgE在过敏组与对照组相比差异有统计学显著性意义（均P〈0．05）。结论过敏性儿童IL-4受体QS76R与血清总IgE有相关性。

中国人群IgE高亲和力受体β链(FcεRIβ)基因-6843G/A多态性位点与哮喘易感性关系的Meta分析

目的探讨中国人群IgE高亲和力受体β链（FcεRIβ）基因-6843G/A多态性与哮喘易感性的关系。方法检索PubMed、Embase、中国学术期刊网全文数据库（CNKI）、万方数据检索系统及维普数据库,收集研究中国人群FcεRIβ基因-6843G/A多态性与哮喘易感性关系的文献进行Meta分析,末次检索时间为2009年10月1日。病例组和对照组基因型分布的比值比（OR）及95%CI为效应指标,应用RevMan 4.2.8软件对各研究原始数据进行统计学分析并检验异质性,采用STATA10.0软件检验发表偏倚。结果根据纳入排除标准,共有9篇文献研究-6843G/A多态性位点,G携带者（GG＋GA）的哮喘发病风险较AA野生型纯合子（AA）增加49%（OR=1.49,95%CI1.01~2.22）。亚组分析显示,G携带者成年发病的风险明显增高（OR=1.83,95%CI1.32~2.52）,而儿童发病风险无显著性差异（OR=1.19,95%CI0.68~2.08）。结论中国人群FcεRIβ基因-6843G/A多态性与哮喘易感性密切相关,突变子G携带者的哮喘发病风险较高。

交联效应在抗IgE抗体诱导致敏嗜碱粒细胞脱颗粒实验中的应用

目的 将二个IgE分子在靶细胞表面通过双价配体产生交联,这一诱导Ⅰ型变态反应的理论,运用到由抗IgE诱导致敏嗜碱粒细胞组胺释放试验(histamine release of basophils test,HRBT)中,以获得组胺(histamine,HA)的高释放率。方法 将IgE的浓度与抗IgE的浓度按不同的比例进行组合,用微量HA荧光测定法观察各配对组对人血细胞中嗜碱粒细胞(basophils,BOS)释放HA的影响。结果 交联组的HA释放率明显高于对照组,t=4.604,P<0.01。结论 当IgE:抗IgE的浓度=2:1时,BOS的HA释放率随该比值的增高而增高;若该比值倒置,则HA释放受到抑制。

夏秋花粉免疫治疗哮喘患者SIL-2R和总IgE的变化

目的 探讨变应原免疫治疗变应性哮喘 SIL - 2 R及总 Ig E水平的变化。 方法 用夏秋花粉浸液按脱敏常规方法对 36例夏秋花粉变应性哮喘患者进行免疫治疗 1年。治疗前后测定 SIL- 2 R和总 Ig E水平。 结果 免疫治疗后临床有效率达 86 .11% ,治疗前非免疫疗法组和免疫疗法组血清 SIL- 2 R和总 Ig E明显高于对照组 (P<0 .0 1,P<0 .0 0 1)。治疗后免疫疗法组 2项指标明显下降 (P<0 .0 1,P<0 .0 0 1)。 5例无效者和非免疫疗法组下降不明显 (P>0 .0 5 )。 结论 免疫疗法能使夏秋花粉变应性哮喘患者血清 SIL - 2 R和总 Ig