水蛭素衍生物基因的克隆及其在哺乳类细胞中的表达

设计特异性更高的水蛭素新突变体。化学合成编码水蛭素基因，并融会了ＲＧＤ３肽编码序列，通过连接、克隆、酶切筛选、ＤＮＡ序列分析，得到真核表达质粒ｐＡＰＲ－ＨＤ，表达质粒转染ＣＨＬ细胞，经Ｇ４１８筛选，获得表达克隆。结果：细胞培液中，重组水蛭素衍生物的活性达到１０ＡＴＵ／ｍｌ，并有抗血小板凝集作用。结论：水蛭素新突变体具有预防血栓性疾病的应用前景，但其表达水平和稳定性有待于进一步提高。

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞凋亡相关基因表达的影响

背景重组水蛭素Ⅲ（rHV3）对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞（LECs）有较好的保护作用，但其分子机制尚不清楚。目的探讨rHV3对半乳糖损伤的人LECs凋亡相关基因表达的影响。方法用本课题组构建的表达重组水蛭素工程菌，参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行水蛭素生物学活性的测定。将培养的人LECs分为3组，培养于含质量分数10％胎牛血清（FBS）的D／F12培养液作为正常组、用含125×10^-3mol／LD一半乳糖的D／F12培养液建立人LECs株SRAOI／04损伤模型为模型组，用2000U／ml（商品单位）rHV3加入部分损伤模型培养液中进行干预作为rHV3组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测各组人LECs内凋亡相关基因的表达，包括醛糖还原酶（AR）、bcl2、bax、p53基因mRNA的表达水平，各目的基因表达丰度用目的基因的吸光度（A）值与3一磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）A值的比值表达。结果与正常组比较，模型组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显高于对照组，差异均有统计学意义（t=3．90E一06、t=8．44E一04、t=5．15E一08，P〈0．叭），而水蛭素干预组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显低于模型组，差异均有统计学意义（t=5．90E一06、t=1．51E．04、t=3．42E一06，P〈0．01）。与正常组比较，模型组人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值明显降低，差异有统计学意义（t=1．86E一05，P〈O．01），与模型组相比，水蛭素干预后人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值显著提高，差异有统计学意义（t=8．56E一05，P〈0．01）。结论D一半乳糖导致人LECs损伤，rHV3可能通过抑制多元醇途径和线粒体介导的凋亡途径对人LECs起保护作用。

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞的保护作用

为研究重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞(HLEC)的保护作用,采用D-半乳糖建立人晶状体上皮细胞损伤模型,用重组水蛭素Ⅲ作用于受损细胞,设置正常组、模型组、低、中和高剂量重组水蛭素Ⅲ组以及阳性药白内停组,观察各组细胞密度和形态,用MTT法检测各组细胞存活率,考察各组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果表明,当D-半乳糖浓度为50×10-3mol/L时,模型组与正常组细胞有显著差异。重组水蛭素Ⅲ作用后受损细胞的存活率和SOD活性显著提高。因此,重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞有明显的保护作用。

重组水蛭素克隆的表达及其产物的分离纯化

目的：在原核细胞中表达具有生物活性的重组水蛭素变异物１（ｒＨＶ１）并进行重组产物的分离纯化研究。方法：以质粒ｐＢＶ２２０为载体，在大肠杆菌ＤＨ５α中表达ｒＨＶ１，发色底物法测定其抗凝血酶生物活性；利用超滤、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０以及凝血酶亲合层析进行重组产物的分离纯化。结果：在大肠杆菌中获得了ｒＨＶ１的活性表达，表达量约占总蛋白的１６．９％，活力达到２０～３０ＡＴＵ／ｍｌ培养液；初步的纯化研究得到了具抗凝生物活性的ｒＨＶ１纯品，ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一条带。结论：重组水蛭素变异物１的活性表达及其分离纯化研究填补了国内空白，为研制国产高效重组抗凝药物带来希望。

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞热应激蛋白表达的影响

探讨重组水蛭素Ⅲ(rHV3)对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞(hLEC)热应激蛋白(Hsp)表达的影响。采用125×10-3mol/LD-半乳糖建立人晶状体上皮细胞SAR01/04损伤模型,用重组水蛭素Ⅲ干预受损细胞,设置正常组、模型组、和重组水蛭素Ⅲ组,用倒置显微镜观察各组细胞密度和形态,RT-PCR检测人晶状体上皮细胞内3种热应激蛋白mRNA的表达。结果显示,125×10-3mol/LD-半乳糖导致人晶状体上皮细胞显著损伤,3种热应激蛋白,即Hsp70、Hsp27和αB-晶体蛋白的mRNA表达显著上调。重组水蛭素Ⅲ的干预使细胞形态趋于正常,细胞内Hsp70、Hsp27和αB晶体蛋白的mRNA表达显著下调。因此,重组水蛭素Ⅲ能有效缓解高浓度半乳糖导致的热应激蛋白应激耐受,从而保护晶状体上皮细胞。

水蛭素变异物1活性多肽基因的化学合成及克隆

为了解决天然水蛭素来源匮乏问题，我们采用基因工程技术进行重组水蛭素的研究。根据水蛭素变异物１（ＨＶ１）的氨基酸序列，选择在原核细胞中高表达的密码子，设计了２２１个碱基对长度的ＨＶＩＤＮＡ片段。分１４个寡核苷酸片段进行化学合成，各片段连接成ＨＶ１全基因后，经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ切点克隆入ｐＵＣ１８／１９质粒，转化大肠杆菌ＪＭ１０５，蓝白菌落法筛选阳性克隆。限制性内切酶实验及ＤＮＡ序列分析证实了ＨＶ１全基因的正确性，克隆成功。并且获得活性表达。

UPLC-MS/MS法测定人尿液中新蛭素及其活性代谢产物水蛭素

目的:建立同时测定人尿液中新蛭素及其活性代谢产物水蛭素的超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)方法,用于注射用重组新蛭素Ⅰ期临床试验健康受试者尿液的药动学研究。方法:采用新蛭素的类似肽MEH作为内标,50μL尿液样品加入等体积的50μL空白人血清经300μL甲醇沉淀蛋白后,通过Waters BEH300 C18色谱柱(300,2.1 mm×50 mm,1.7μm)分离,柱温为40℃,流动相为水(含0.1%甲酸)-乙腈(含0.1%甲酸),梯度洗脱,流速为0.3 mL·min-1,色谱运行时间为5 min,进样体积为5μL。采用电喷雾电离源正离子多反应监测检测。新蛭素,水蛭素和内标的监测反应质荷比(m/z)分别为1 042.4→1 280.4,1 152.1→1 352.8,1 063.3→1 332.1。对该方法的选择性与残留、标准曲线与定量下限、准确度与精密度、基质效应与回收率、稀释可靠性与稳定性进行了全面的验证。结果:新蛭素和水蛭素的线性范围均为10~2 000 ng·mL^-1,定量下限均为10 ng·mL^-1,新蛭素和水蛭素的批内和批间精密度为5.4%~13.9%和3.7%~12.2%,准确度为-6.6%^-0.2%;残留、基质效应与回收率、稀释效应与稳定性均在可接受的范围内。结论:该方法符合生物分析指导原则的要求,满足注射用重组新蛭素临床Ⅰ期药动学的尿液排泄研究。