水蛭(日本医蛭)皮肤及消化系统组织学研究

目的:对水蛭(日本医蛭)进行组织学研究,为更好的保护这一宝贵中药材提供参考。方法:利用组织学切片及显微拍照方法,对日本医蛭皮肤及消化系统进行分析研究。结果:日本医蛭体壁可分为5层,分别是:表皮层、上皮层、真皮层、肌肉层、葡萄状组织。日本医蛭消化系统主要由口、咽、食道、嗉囊、肠、直肠以及肛门等部分构成。结论:本研究可为日本医蛭养殖学、病理学以及生理功能研究提供依据和基础资料。

日本医蛭化学成分研究

目的研究动物日本医蛭Hirudo nipponica Whitman的化学成分。方法各种色谱方法进行分离纯化,理化性质和光谱数据鉴定结构。结果从日本医蛭中分离并鉴定了8个化合物,其结构分别为:菜油甾醇(campesterol)(1),十六烷基甘油醚(2),(2S,3S,4E)-4,5-二脱氢十八鞘氨醇二十五烷酸脂肪酰胺(3),1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-2-N-(二十二酰基)-E-4,5-二脱氢-3-羟基十八脑苷脂(4),丁二酸(5),次黄嘌呤(6),丙胺酸(7),异亮氨酸(8)。结论以上化合物均为首次从该动物中分离得到。

日本医蛭生境水质及生物学特性初探

目的:研究日本医蛭的野外生境水域和生物学习性。方法:采用野外调查与室内养殖观察相结合的方法。结果:日本医蛭野外生存水域水质恶劣,达不到水产养殖常用Ⅲ类水标准,其主要污染源为氮(N)、磷(P)、化学需氧量(COD);休眠结束期在野外捕获的日本医蛭体重较轻,平均体重为0.114 g,体重范围多分布在0.05~0.15 g之间;其性成熟率随体重增加而增加,体重大于0.25 g时性成熟率为100%。日本医蛭生活史包括了休眠、产茧、孵化、生长等阶段,由于养殖地不同,各阶段在时间上存在较大差异。温度对日本医蛭的行为影响较大,16℃以下逐渐进入休眠,最佳的生长温度为28~32℃。结论:日本医蛭野外生境水质污染严重;其体重较轻;温度是影响日本医蛭生理状态的主要因素。

基于蛋白免疫印迹的水蛭抗凝活性成分研究

目的:建立Native-PAGE结合Western blot检测水蛭活性多肽与凝血酶相互作用产物的方法,探究水蛭有效抗凝成分。方法:本研究分别提取宽体金线蛭、日本医蛭两种水蛭虫体总蛋白及日本医蛭唾液蛋白,用凝血酶滴定法测定其抗凝血酶活性,Western blot检测凝血酶-活性多肽复合体。结果:研究发现两种水蛭Native-PAGE-WB均检测到凝血酶-活性多肽复合体,且SDS-PAGE-WB检测到复合体变性后产生凝血酶条带。结论:建立的Native-PAGE-WB法可有效检出水蛭活性多肽和凝血酶相互作用产物,且发现同水蛭素类似,宽体金线蛭活性抗凝多肽与凝血酶在体外也能形成稳定的蛋白复合体。

基于三代高通量测序技术的不同养殖环境下日本医蛭微生物多样性研究

目的:研究不同水源养殖的日本医蛭Hirudonipponica Whitman肌肉、肠道组织样本的细菌群落结构,分析除氯自来水养殖的可行性及日本医蛭相关的重要有益微生物。方法:分别在地下水和除氯自来水的循环养殖系统中进行日本医蛭养殖,采用PacBio三代高通量测序技术对不同水源养殖水蛭的肌肉和肠道组织样品进行菌种初步分类鉴定及微生物群落组成分析。结果:与地下水养殖的水蛭相比,除氯自来水养殖的水蛭样本表现出更简单的微生物群落结构,且黏液菌属(Mucinivorans)、梭杆菌属(Fusobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)等有潜在致病风险的菌属相对丰度明显低于地下水养殖组。结论:采用除氯自来水开展水蛭养殖工作是可行的。与日本医蛭相关的共生菌(Aeromonas和Rikenella)及有益微生物在水蛭的生长发育过程中起着重要的作用,提示可以利用环境或饵料中的有益微生物来提高日本医蛭的产量。

水蛭ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的建立并优化水蛭ISSR-PCR反应体系及扩增程序,为水蛭进行遗传多样性研究提供依据。方法使用引物ISSR825,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择。结果在25μL总体积中,其中包括10×PCR缓冲液2.5μL、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP0.25 mmol/L、引物0.8μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 2.0 ng/μL,最佳退火温度为49.7℃。结论所建立的最佳ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可用于水蛭遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析。

实时细胞电子分析技术用于水蛭、三七质量评价的初步研究

采用实时细胞电子分析技术测定水蛭、三七不同样本的时间剂量依赖性细胞反应曲线(TCRPs),对不同产地样本的TCRPs进行分析,并对生物活性强弱进行排序。同时,采用中国药典2010年版中的化学检测法和凝血酶滴定法分别对水蛭、三七各样本进行同步分析,比较不同检测方法得出结果的相关性。可见以实时细胞电子分析技术为基础的细胞生物活性测定结果与另两法所得结果基本一致。说明本技术能反映中药生物活性,有望为中药质量标准研究提供一种新方法。