Histatin5可溶性突变体融合蛋白在大肠杆菌中的优化表达

目的优化表达条件,提高Histatin5突变体融合蛋白(GST-HST5)表达量。方法比较不同IPTG诱导浓度、不同诱导后培养时间,确定优化表达条件。结果 histatin5突变体融合蛋白经1mmol/L IPTG,37℃诱导6h,表达量最高。结论诱导表达条件对Histatin5突变体融合蛋白表达有较大影响。

多肽dhvar4的抗细菌活性和细胞毒性研究

目的 研究多肽dhvar4的抗细菌活性及其细胞毒性。方法 人工合成多肽dhvar4 ,测定不同质量浓度dhvar4作用后的细菌生长曲线,检测dhvar4抗细菌活性;用MTT法检测不同质量浓度dhvar4对L- 0 2、ECV- 30 4、2 93和3T3细胞的细胞毒性;用溶血性实验检测不同质量浓度dhvar4对血红细胞的溶血性。结果 dhvar4在4μg/m l质量浓度以上对金黄色葡萄球菌BAA4 2和肠球菌EF36 4 18的生长有明显的抑制作用。在15 0 μg/m l高质量浓度条件下,哺乳动物正常细胞存活率为6 8%～92 % ,其L D50 大于15 0 μg/m l。最大检测质量浓度(180 μg/ml)下,dhvar4对血红细胞几乎没有溶血作用。结论 dhvar4具有抗细菌作用,无明显细胞毒性和溶血性,具有开发成为安全高效抗细菌药物的潜在价值。

唾液富组蛋白5的原核表达、纯化与抗菌活性鉴定

设计一对3′端互补、5′端带酶切位点的引物,用PCR扩增唾液富组蛋白5(H5)基因(h5),将载体pGEX4T-2和h5双酶切、连接、转化DH5α,将筛选鉴定的重组质粒pGEX4T-2-h5转化BL21(DE3)。诱导重组菌BL21(DE3)-pGEX4T-2-h5表达,纯化融合蛋白GST-H5,用Thrombin切去GST标签获取重组H5(rH5),测试rH5抗白色念珠菌(Candida albicans)活性。试验成功构建了重组载体pGEX4T-2-h5,在37℃重组菌BL21(DE3)-pGEX4T-2-h5生长至OD600 nm=0.6时用1 mmol/L IPTG于20℃诱导9 h,可获得高水平表达的融合蛋白GST-H5;酶切后获得的rH5对白色念珠菌生长有较强的抑制作用,rH 5产率约2 mg/L。

基于杂合肽H5LL活性的生物信息学分析和重组乳酸菌表达载体的构建

目的:以人源性抗菌肽(AMPs)富组蛋白5 (Hst5)和LL-37为亲本,设计新型杂合肽H5LL,并通过基因工程技术构建重组乳酸菌表达载体,实现AMPs的高效和安全表达。方法:采用生物信息学方法对H5LL进行理化参数、亲/疏水性、剪切位点、磷酸化位点、信号肽、跨膜区域、亚细胞定位和二级结构预测;将目的序列和空载质粒pMG36e经HindⅢ及KpnⅠ双酶切后,构建乳酸菌重组表达载体pMG36e-H5LL,克隆转化获得含目的基因的重组质粒。结果:H5LL成为AMPs的可能性较高,含36个氨基酸,相对分子质量为4 625 380,总电荷数为+10,具有亲水性;有3个磷酸化位点,无糖基化位点;属于膜内蛋白,无跨膜区域,无信号肽;亚细胞定位预测,线粒体靶向肽的可能性为0.333。二级结构中α-螺旋结构和β-转角占比分别52.78%及22.22%,三级结构中α-螺旋数量较多。含目的基因的重组质粒PCR电泳,于138 bp处有单一特异性条带;双酶切电泳,重组质粒在136和3 500 bp处有清晰条带。结论:设计并合成的新型杂合肽H5LL具有较高稳定性、抑菌活性和低毒性;成功构建重组乳酸菌表达载体pMG36e-H5LL。