变异链球菌hit基因缺陷菌株的构建

目的构建hit基因缺陷型变异链球菌株并验证其细胞周期调控的功能。方法从变异链球菌株ATCC25175中提取基因组DNA,采用PCR扩增技术,将hit基因上下游片段克隆到pFW5质粒(壮观霉素抗性)上以构建重组质粒;利用该菌株天然遗传转化机制,将线性化重组质粒转入由其感受刺激多肽(competence stimulating peptide,CSP)刺激产生变异链球菌感受态中,进行同源重组;再通过壮观霉素抗性筛选,结合PCR产物电泳和Sanger法测序,筛选鉴定hit基因缺陷型变异链球菌株;最后在BHI培养基中培养,检测其生长速率。结果从ATCC25175变异链球菌基因组DNA中,克隆hit基因上游约856 bp、下游约519 bp片段到pFW5质粒的两个多克隆位点区间(MCS⁃I和MCS⁃II),经双酶切和PCR测序鉴定,得到重组质粒pFW5_hit_Up_Down。线性化该重组质粒,转入由CSP刺激产生变链感受态中进行同源重组;再通过壮观霉素BHI培养基多次抗性筛选,hit基因片段的PCR产物电泳和Sanger测序筛选出hit基因缺陷变异链球菌株,该缺陷菌株较其亲本菌株生长更快速(P<0.001)。结论获得具有遗传性状hit基因缺陷变异链球菌株,hit基因产物调控变异链球菌生长周期。

伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株16SrRNA基因的检测与分析

目的探讨伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株的菌种相关性或亲缘性。方法分离提取伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株及其亲代细菌型的染色体DNA,采用16SrRNA基因引物进行PCR扩增,对扩增的16SrDNA产物进行琼脂糖凝胶电泳和碱基序列测定。结果经PCR扩增后伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株及其亲代细菌型均获得了大小约230 bp的特异性片段,其产物经琼脂糖凝胶电泳可见在230 bp处出现与其亲代细菌型一致的DNA条带,碱基序列测定显示具有同其亲代细菌型一致的核苷酸序列。结论伤寒沙门菌的细胞壁缺陷突变株虽然丧失了常规细菌学可检测的绝大多数表型特征,但检测16SrRNA基因能快速、灵敏地对其进行菌种相关性或亲缘性的分析与鉴定,并且也有利于对各种不能自发返祖的细菌稳定L型进行菌种相关性或亲缘性的分析与鉴定。

南昌霉素高产菌株的链霉素抗性基因突变诱变筛选研究

通过链霉素对南昌霉素 (Nanchangmycin)产生菌NS 41 80菌株孢子的致死浓度测定基础上 ,采用诱变剂甲基磺酸乙酯 (EMS)的不同诱变剂量对菌株孢子进行诱变处理 ,诱变处理的孢子涂布在含链霉素 ( 1 0 μg/mL)致死浓度的高氏平板上 ,获得了大量的链霉素抗性基因 (str)突变株。然后从 3,0 0 0株链霉素抗性基因 (str)突变株中通过初筛获得比诱变出发菌株产素能力提高 2 0 %以上的菌株 2 0 2株。再进一步通过摇瓶复筛 ,获得比出发菌株产素能力分别提高 1 0 0 %、 2 0 0 %和 30 0 %高产菌株为 48株 ,7株和 1株 ,分别为复筛菌和初筛菌株的 2 3 76%和 1 60 % ;3 46%和 0 2 3% ;0 5 %和 0 0 3%。将产素能力提高 2 4 0 %以上 5个菌株连同出发菌株连续 3批次进行摇瓶发酵结果 ,5个突变株的产素能力均比出发菌株的产素能力提高 5 7%～ 96 4% ,其中突变株 80 5 3 1 65菌株摇瓶发酵单位达 6,0 0 0 μg/mL以上 ,3批次摇瓶平均发酵单位达 5 ,85 5 μg/mL。建立了南昌霉素高产菌株的链霉素抗性基因突变诱变快速高效的筛选方法。

梅岭霉素高产菌株链霉素抗性基因突变株筛选

通过链霉素对梅岭霉素 (Meilingmycin)产生菌南昌链霉菌NS 41 80菌株孢子致死浓度的测定 ,采用诱变剂EMS 4种不同剂量对菌株孢子进行诱变处理 ,然后涂布在含链霉素致死浓度的高氏平板上 ,获得了大量的链霉素抗性基因 (str)突变株。并进一步筛选到梅岭霉素高产菌株 80 5 1 1 2 2 1 ,在摇瓶条件下 ,只产梅岭霉素不产南昌霉素 ,梅岭霉素活性单位达 1 ,52 1 μg/mL,比NS 41 80的摇瓶发酵单位 855μg/mL提高了 77 9% ,该菌株连续传 6代进行摇瓶发酵 ,其F2 代和F3 代发酵单位稳定 ,F4代至F6 代随着代数增加 ,梅岭霉素发酵单位急速下降。通过EMS诱变剂量分别与抗药性突变率和str突变株产梅岭霉素产量的产势统计分析表明 ,菌株抗药性突变与产量突变密切相关。产量突变的EMS剂量高于str突变剂量 ,从而建立了梅岭霉素产生菌链霉素抗性基因突变筛选方法。

猪链球菌2型二元信号转导系统ciaR基因敲除突变株的构建及生物学功能研究

目的构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33二元信号转导系统1094HK/1095RR的反应调节因子ciaR基因敲除突变株(ΔciaR),并研究ΔciaR的生物学功能。方法和结果基于同源重组原理筛选ciaR基因缺失株,PCR分析及Southern杂交结果均显示突变株构建成功。通过检测OD600值绘制生长曲线,发现突变株在37℃和40℃其OD600值均明显低于野生株;与40mmol/L过氧化氢共作用15min后涂板计数,突变株存活率明显低于野生株;不同pH值的培养基中培养,发现在pH5.0的酸性环境中突变株OD600值明显低于野生株;野生株与突变株对BALB/c小鼠攻毒(约1×109CFU/只),各10只,两组16h后均死亡9只。结论成功获得05ZYH33ciaR基因敲除突变株;发现删除ciaR基因会导致细菌的生长繁殖能力减弱,抗氧化应激能力下降,在酸性环境生长存活能力下降;但对小鼠毒力无差别。

BALB/c鼠口服免疫猪水肿病大肠杆菌基因突变菌株的免疫效果

为了研究猪水肿病(ED)大肠杆菌SLT-Ⅱe基因突变菌株作为口服疫苗的免疫效果,本实验用已构建的猪ED大肠杆菌SLT-Ⅱe基因突变菌株口服免疫BALB/c小鼠,检测其血清中的IgG抗体及粪便和肠黏液中的sIgA抗体水平,并进行淋巴细胞增殖检测及攻毒保护实验。结果表明该基因突变菌株具有良好的免疫性,能诱导小鼠体内产生IgG和sIgA抗体,并且能引起T淋巴细胞增殖反应。攻毒保护实验结果显示,口服免疫突变菌株能对小鼠提供良好的保护,保护率为75%(15/20)。本研究结果证明,该大肠杆菌基因突变菌株在小鼠体内能激发体液免疫和细胞免疫反应,可作为猪ED口服疫苗的候选菌株。

鼠伤寒沙门菌stn基因突变株的构建与毒力检测

作者构建了鼠伤寒沙门菌肠毒素 (stn)基因插入失活型与缺失型突变的重组自杀载体质粒 ,通过重组自杀质粒中的突变stn基因与鼠伤寒沙门菌株 2 0 0 0染色体上野生型stn基因发生同源交换 ,筛选获得stn基因突变的同源突变菌株。在小鼠体内检测菌株stn基因产物生物活性的结果表明 ,突变菌株诱发小鼠肠液分泌的能力较野生菌株明显减弱 ,而小鼠口服突变菌株的半致死剂量较野生株明显增高 ,提示stn基因是鼠伤寒沙门菌致病机制中一个较为重要的毒力因子。

金顶侧耳不同交配型营养缺陷突变菌株的制备

以金顶侧耳的营养缺陷突变菌株为供试菌株,在确认其交配型的基础上,配制杂交株,利用其减数分裂中基因的高频率重组性制备不同交配型的营养缺陷突变菌株。结果表明:除突变型Ade2-、Ade5-、Pdx2-各自获得3种不同交配型的营养缺陷突变菌株外,其他突变型均获得4种不同交配型的营养缺陷突变菌株,共计获得具有不亲和性因子和营养缺陷型双重标记的金顶侧耳菌株(包括供试菌株)133株。

临床分离铜绿假单胞菌喹诺酮耐药株gyrA基因突变及其对β-内酰胺类药物敏感性研究

利用 PCR、限制性片段多态性分析 (RFL P)、DNA单链构像多态性分析 (SSCP)和 DNA测序等方法 ,对 10株成都地区临床分离耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌 gyr A基因进行研究。结果表明 ,成都地区耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌 gyr A的喹诺酮耐药决定区编码第 83位氨基酸密码子表现出高频单点突变 (10株中有 8株 ) ,其突变方式为 ACC→ATC。gyr A的 PCR扩增产物 Sac II酶切片段与测序结果一致。SSCP的带谱与测序结果比较 ,除 1株 (PSA2 )的 SSCP带谱与标准株相同 ,但测序结果有点突变外 ,其余菌株与测序结果一致。因此 ,利用 PCR- SSCP- RFL P系统 ,可快速、准确的检测耐喹诺酮类药物的铜绿假单胞菌 gyr A中至少一个碱基的差异。用二倍稀释法测定喹诺酮和 β-内酰胺类药物对耐药突变株体外抗菌活性 ,结果表明 ,铜绿假单胞菌 gyr A基因突变株对诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、亚胺培南和哌拉西林表现出不同的敏感性。试验所用 8株突变株对诺氟沙星和环丙沙星表现出高水平抗性 ;3株对左氧氟沙星敏感 ;3株对头孢他啶和哌拉西林表现出耐药 ,2株对亚胺培南耐药。

变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因gluA突变的检测及其意义

目的:检测变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因gluA是否发生突变,阐明变形链球菌耐氟菌株耐酸性的变化。方法:采用变形链球菌国际参考株在体外人工诱导形成变形链球菌耐氟菌株,碱裂解法提取变形链球菌耐氟菌株的基因组,根据GenBank上发表的变形链球菌不同菌株中耐酸相关基因gluA的基因序列,在保守区设计上下游引物,以变形链球菌耐氟菌株的基因组为模板进行PCR扩增,挤胶法回收PCR产物,利用pMD18-T载体进行T/A克隆,构建重组质粒,进行酶切鉴定及测序。结果:变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因gluA的基因序列与GenBank报告的变形链球菌耐酸相关基因gluA序列经BLASTN比对完全相同,没有碱基发生突变。结论:变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因gluA未发生突变,该基因对变形链球菌耐氟菌株的耐酸性没有影响。

一株多重耐药大肠杆菌耐喹诺酮gyrA基因突变的研究

临床获得 1株鸡致病性大肠杆菌CE0 1,进行药敏、质粒转化、耐药质粒消除试验 ,结果该菌对 11种受试抗菌药物全部呈高度耐药 ,其中氧氟沙星的MIC≥ 5 0 μg/ml,且含有喹诺酮抗性质粒 ,溴化乙淀和黄连素作为消除剂作用 48小时可使其喹诺酮抗性质粒消除 ,耐药水平显著下降。聚合酶链反应 (PCR)扩增该菌gyrA基因喹诺酮耐药决定区 (QRDR) ,质粒DNA和染色体DNA均可扩增出长度为 6 6 8bp的PCR产物片段。经测序分析 ,两者基因序列相同率为 98.17%,相同位点突变相同的碱基有 5个 ,相同位点突变不同的碱基有 2个 ;与基因数据库Swanberg等报道的大肠杆菌gyrA基因相应序列比较 ,该菌质粒DNAPCR产物同源率 97.8%,有 13个位点发生突变 ,3个氨基酸被替换 ;染色体DNAPCR产物同源率 98%,有 12个位点发生突变 ,2个氨基酸被替换。用放射性同位素α_3 2 P分别标记CE0 1菌株染色体DNA和质粒DNA的PCR扩增片段制备探针 ,对CE0 1菌株进行检测。质粒DNA和染色体DNA分别与质粒探针和染色体探针杂交出现典型的阳性杂交斑。证实该菌株质粒和染色体上同时存在耐喹诺酮gyrA突变基因 ,对喹诺酮的耐药性是质粒介导和染色体突变共同作用的结果。

人Elongator复合物Elp3亚基基因可显著补偿酵母elp3缺失菌株的生长缺陷

从HeLa细胞中分离的人的Elongator复合物在组成及与RNAPⅡ的作用方式上与酵母的E- longator复合物十分相似,但对其功能研究极少。为了研究人的Elongator复合物催化亚基Elp3的功能,将人elp3等基因转入酵母elp3基因缺失的突变菌株(elp3Δ菌株),并对转化菌株进行功能互补实验和ssa3和pho5基因表达分析,结果表明人elp3基因可显著恢复突变菌株对高温和Caffeine的敏感性,在低磷条件下显著补偿了突变株pho5基因表达延迟的缺陷,并可在热激条件下提高ssa3基因的表达。含酵母elp3非HAT区和人elp3 HAT区的融合yhelp3对上述缺陷有着更强的补偿能力。而HAT区催化结构域缺失的yhelp3HAT没有任何补偿能力,表明人Elp3亚基可能与酵母的该亚基功能相似,人Elp3的HAT活性也为其行使功能所必需。

定向筛选组氨酸营养缺陷型突变菌株的研究

从机理上探讨了青霉素浓缩法中关键参数确定的依据。确定饥饿培养至菌浓不再增加为止。青霉素作用前培养至细胞生长进入对数期。当 5 0 %～ 6 0 %细胞转变为原生质球时 ,停止青霉素的作用。在此条件下 ,组氨酸营养缺陷型突变菌株的获得率达 8%。

枯草芽孢杆菌S44菌株ituD基因敲除突变株的构建

利用同源重组基因敲除方法构建了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S44 ituD基因同源突变株。菌落PCR、RT-PCR、SDS-PAGE结果均显示ituD基因缺失突变株构建成功。野生株与突变株的菌落形态、生长速率以及抑菌活性均有显著差异。抑菌活性试验结果显示,突变株抑菌活性显著减弱,成功构建的ituD基因突变株为进一步研究ituD基因的生物学功能奠定了基础。

大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因缺陷型菌株的筛选

本研究以大肠杆菌 (含有 β-半乳糖苷酶基因 )为试验对象 ,用氮 -甲基 -氮 -硝基 -氮 -亚硝基胍对其进行诱导突变 ,在选择培养基上对突变体菌株进行筛选。结果成功地对鸡消化道共生乳酸菌进行了诱导突变 ,筛选到了β-半乳糖苷酶基因缺陷型的大肠杆菌受体菌株 ,从而为构建以 β-半乳糖苷酶基因为选择标记的载体表达系统奠定了基础。

耐氧氟沙星的结核分枝杆菌临床分离株的gyrA基因点突变特点

目的研究结核分枝杆菌临床分离株的gyrA基因点突变位点和突变频率,了解目前结核分枝杆菌临床分离株耐喹诺酮类药物的基本特点。方法以我室保藏H37Rv（ATCC272294）,H37Ra （ATCC251 77）菌株以及由我所参比实验室提供的具有在改良罗氏培养基上获取的。

牦犊牛副伤寒基因缺陷型菌株的筛选及其免疫原性的研究

利用诱变剂亚硝基胍(NTG)处理从患副伤寒牦犊牛分得的致病菌——都柏林沙门氏菌8109株,筛选出7株对链霉素具有依赖性的基因缺陷型菌株.对其中三株作了进一步的研究.结果发现,所试菌株减毒情况良好,能保护小鼠对强毒母株的攻击.用其中一株免疫2～3月龄牦犊牛,能产生血清凝集滴度高达1:2560的抗体反应,有在本种动物(牦犊牛)进一步作兔疫保护试验的价值.

伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株的生物学特性

目的探讨细胞壁缺陷对细菌生物学特性的影响。方法诱导获得伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株,采用电镜和玻片凝集试验,与亲代细菌型进行比较研究。结果伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株在营养琼脂平板上形成珊瑚红色的圆形、凸起、湿润、边缘整齐而不透明的菌落,低倍镜下菌落为圆球形细胞堆积的颗粒样,不被发酵糖类和沙门菌H或O抗血清凝集。结论细胞壁缺陷可导致细菌丧失部分代谢特性。