乙型脑炎病毒非结构蛋白的表达及与hnRNP K的相互作用

【目的】为探明JEV病毒复制与宿主蛋白的关系。【方法】首先构建非结构蛋白质粒,然后将构建成功的非结构蛋白的质粒转染至Vero细胞中,24 h在荧光显微镜下观察蛋白表达情况,再分别与pCMV-MYC-hnRNP K质粒同时转染至Vero细胞中,培养24 h,收取细胞蛋白样,进行Co-IP试验相关步骤,用Western-blot实验进行结果呈现,得出试验结果。【结果】构建的非结构蛋白质粒在Vero细胞中可以表达,通过与表达hnRNP K蛋白的质粒共转染,通过Co-IP试验经Western-blot结果分析能够得出JEV的NS1与hnRNP K之间存在相互作用,JEV的NS2a、NS3、NS5与宿主hnRNP K之间不存在相互作用。【结论】JEV的NS1蛋白与宿主蛋白hnRNP K存在相互作用,为JEV非结构蛋白的研究进一步拓宽了思路,同时为JEV病毒在宿主细胞中的生命活动周期的研究提供了基础,为深入研究JEV病毒复制提供了新方向。

HMBA诱导人成骨肉瘤MG-63细胞分化过程中hnRNP A2/B1的表达与定位

背景与目的:核基质蛋白的差异表达与细胞癌变和增殖分化调控关系密切。本研究观察了hnRNP A2/B1在诱导分化处理前后人成骨肉瘤MG-63细胞核基质中的存在和分布,及其与Actin、Prohibitin的共定位关系。方法:选择性抽提经环六亚甲基双乙酰胺(hexamethylene bisacetamide,HMBA)诱导处理前后的MG-63细胞核基质,并运用双向电泳、质谱分析、蛋白质印记杂交、免疫荧光、激光共聚焦等技术检测hnRNP A2/B1在核基质中的表达与定位变化,及其与相关蛋白的共定位关系。结果:双向电泳及蛋白质印迹杂交结果证实了hnRNP A2/B1存在于MG-63细胞核基质蛋白组分中,并在HMBA处理后细胞核基质中表达下调;免疫荧光显微镜观察显示hnRNP A2/B1定位在核基质上,经HMBA处理后hnRNP A2/B1表达减弱。激光共聚焦显微镜观察结果显示,hnRNP A2/B1与细胞核基质蛋白组分Actin、细胞增殖相关调控因子Prohibitin具有共定位关系,但在诱导处理后细胞内的共定位关系减弱。结论:hnRNP A2/B1在MG-63细胞诱导分化过程中的表达分布,及其与Actin、Prohibitin的共定位关系的改变对MG-63细胞分化具有重要影响,值得进一步探索和研究。

人肺癌细胞株中hnRNP A_2/B_1表达的研究

目的 研究人肺癌细胞株中核内不均一核糖核蛋白 (hnRNP)A2 /B1及hnRNPB1的表达。方法 采用特异性hnRNPA2 /B1及hnRNPB1引物 ,应用RT PCR方法研究肺癌细胞株hnRNPA2 /B1mRNA的表达 ,以抗hnRNPB1单克隆抗体免疫细胞化学染色方法研究肺癌细胞hnRNPA2 /B1蛋白的亚细胞定位。结果 RT PCR显示人肺腺癌细胞株SPC A1及Y 90 ,小细胞肺癌细胞株NCI H44 6及鳞癌细胞株A43 1均表达hnRNPA2 /B2 及hnRNPB1,其PCR产物分子量分别在 661及 10 3 9bp左右 ,与预期大小的hnRNPA2 /B1cD NA片断相符。免疫细胞化学研究发现 ,肺腺癌细胞株SPC A1及Y 90 ,小细胞肺癌细胞株NCI H44 6及鳞癌A43 1的细胞浆及细胞核内均可见特异的hnRNPB1染色 ,鳞癌A43 1及小细胞肺癌NCI H44 6hnRNPB1染色较肺腺癌细胞株SPC A1及Y 90明显。结论 肺癌细胞株hnRNPA2 /B1及hnRNPB1表达明显增高。

颅咽管瘤p21及hnRNP A2/B1表达的研究

目的分析颅咽管瘤中细胞增殖相关基因p21及hnRNP A2/B1在蛋白水平的表达,探讨其在颅咽管瘤细胞增殖中的意义。方法采用免疫组化S-P法分别检测p21及hnRNP A2/B1在81例颅咽管瘤中的表达,分别计数p21标记指数(p21 LI)和hnRNP A2/B1标记指数(hnRNP A2/B1 LI),对检测结果进行统计学分析。结果①hnRNP A2/B1主要在颅咽管瘤细胞的核中表达,部分在胞浆中表达,造釉细胞型颅咽管瘤的hnRNP A2/B1 LI(51.723±8.313)%显著高于鳞状乳头型(45.347±7.513)%,P<0.05;②p21在颅咽管瘤细胞核中表达,鳞状乳头型颅咽管瘤中的p21 LI(34.047±6.772)%显著高于造釉细胞型肿瘤(28.235±4.600)%,P<0.05;③p21及hnRNPA2/B1之间在颅咽管瘤中的表达呈负相关(r=-0.238)。结论p21及hnRNP A2/B1在不同类型颅咽管瘤中的表达分别呈明显的差异性。造釉细胞型颅咽管瘤细胞活跃的增殖能力,可能是影响其预后的重要机制之一。

hnRNP A_2/B_1、LN-R在非小细胞肺癌的表达及临床意义

目的 探讨异质性细胞核核糖蛋白 A2 / B1 ( hn RNP A2 / B1 )、层粘连蛋白受体 ( L N- R)表达对非小细胞肺癌 ( NSCL C)的诊断价值及与 NSCL C临床病期、淋巴结转移的关系。方法 采用免疫组织化学方法检测 83例原发性 NSCL C、 32例肺良性肿瘤及 2 0例正常肺组织的 hn RNP A2 / B1 、 L N- R表达。结果 NSCL C组 hn-RNP A2 / B1 、L N- R表达阳性率分别为 79.5 % ( 6 6 / 83)和 6 7.5 % ( 5 6 / 83) ,明显高于肺良性肿瘤组及正常肺组 (P <0 .0 5 ) ,肺良性肿瘤组阳性率与正常肺组无差异 ( P >0 .0 5 )。有淋巴结转移者 hn RNP A2 / B1 、 L N- R阳性率分别为 88.0 %和 76 .0 % ,明显高于无淋巴结转移者 ( 6 6 .7%、 5 4 .5 % ) ( P <0 .0 5 ) ; ～ 期 hn RNP A2 / B1 、 L N-R阳性率 ( 89.1%、 80 .4 % )明显高于 ～ 期患者阳性率 ( 6 7.6 %、 5 1.4 % ) ,P <0 .0 5。结论 hn RNP A2 / B1 、L N- R表达对 NSCL C诊断、预测病情及判断淋巴结转移均具有重要的临床价值。

榄香烯乳对肺腺癌A549细胞hnRNPA2/B1的mRNA及蛋白表达的影响

目的 :观察榄香烯乳对人肺腺癌细胞株A5 4 9细胞hnRNPA2 /B1mRNA及蛋白表达的影响。方法 :选用A5 4 9细胞株 ,应用MTT法检测细胞增殖 ,显微镜下观察细胞形态变化 ,逆转录—聚合酶链反应 (RT PCR)检测hnRNPA2 /B1mRNA表达 ,蛋白印迹法检测hnRNPA2 /B1蛋白表达。结果 :榄香烯乳对A5 4 9细胞体外增殖有显著抑制作用 ,且呈时间和剂量依赖性 ,其IC50 值为 15 μg/ml,hnRNPA2 /B1mRNA及蛋白表达水平均有下降。 结论 :榄香烯乳可抑制肺腺癌A5 4 9细胞增殖 ,致其hnRNPA2 /B1的mRNA和蛋白表达水平均有下降。

非小细胞肺癌hnRNP A2/B1免疫组化及定量测定的临床意义

目的 :探讨 hn RNP A2 / B1对非小细胞肺癌 (NSCL C)的诊断价值及与 NSCL C临床病期、淋巴结转移的关系。方法 :标本系胸外科手术切除的石蜡包埋组织或新近手术切除标本 ,其中原发性 NSCL C39例、肺良性肿瘤 2 2例、正常肺 5 0例 ,各组年龄、性别均具可比性。采用免疫组化 S- P法和流式细胞术 (FCM)分别检测肺组织 hn RNP A2 / B1的表达及细胞内 hn RNPA2 / B1的含量。 结果 :(1) NSCL C组 hn RNP A2 / B1免疫组化表达阳性率 (74 .4 % )显著高于肺良性肿瘤组 (4 0 .1% ,P<0 .0 1)及正常肺组 (38.0 % ,P<0 .0 1) ,NSCL C组中有淋巴结转移者阳性率 (94 .7% )明显高于无淋巴结转移者 (5 5 .0 % ,P<0 .0 5 ) ;(2 ) NSCL C细胞内 hn RNP A2 / B1定量测定含量 (6 7.2 5± 14 .0 2 ,阳性率 82 .1% )显著高于肺良性肿瘤细胞 (31.79±6 .79,阳性率 4 .5 % ,P<0 .0 1)及正常肺细胞 (30 .15± 5 .85 ,阳性率 0 ,P<0 .0 1) ,NSCL C组中有淋巴结转移者阳性率 (10 0 % )明显高于无淋巴结转移者 (6 5 .0 % ,P<0 .0 5 )。 结论 :hn RNP A2 / B1对 NSCL C的诊断、病情预测、判断淋巴结转移的程度均具有重要的临床价值。 FCM与免疫组化方法相比 ,具有阳性率高、简便、快速等优点。

痰脱落细胞hnRNPA2/B1检测对肺癌诊断价值的探讨

目的:检测痰脱落细胞hnRNPA2/B1在肺癌诊断中的敏感性和特异性,探讨其对肺癌诊断价值。方法:采用免疫细胞化学染色方法,利用单克隆抗体检测临床可疑肺癌患者痰脱落细胞中hnRNPA2/B1的表达情况。结果:痰脱落细胞hnRNPA2/B1免疫细胞化学检查的敏感性为80.8%(21/26),特异性为78.9%(15/19),显著优于常规细胞学检查。结论:hnRNPA2/B1检查敏感性、特异性高,可用于肺癌的辅助诊断。

hnRNP K调控细胞自噬参与急性髓系白血病阿霉素耐药研究

目的:探索核内不均一的核糖核蛋白K(hnRNP K)调控细胞自噬参与急性髓系白血病耐药机制,为白血病治疗提供新的分子标志物。方法:应用荧光定量PCR技术,分别从临床标本及细胞株水平验证hnRNP K与髓系白血病耐药的关系;利用RNA干扰技术调节hnRNP K的表达水平,Western blot方法检测细胞自噬相关蛋白LC3I/Ⅱ表达变化,并进一步检测hnRNP K调控前后细胞对化疗药物(阿霉素)的敏感性。结果:在骨髓未缓解及复发的原代细胞及耐药细胞株中,hnRNP K的表达水平明显增高,而细胞自噬相关蛋白LC3I/Ⅱ表达水平也明显升高,将hnRNP K的表达水平降低后,LC3I/Ⅱ蛋白水平亦降低,而细胞对于阿霉素的敏感性可以恢复。结论:hnRNP K可能通过调控细胞自噬参与急性髓系白血病阿霉素耐药的形成。

抗hnRNP B1单克隆抗体-顺铂交联物对人肺腺癌细胞A549的体外靶向生长抑制作用

目的证实hnRNP B1单克隆抗体与顺铂(DDP)的交联物可与肺癌细胞发生特异性结合,并研究该交联物在体外的靶向抗癌作用。方法采用人肺腺癌细胞株A549常规体外培养传代。细胞分为DDP组、hnRNP B1单抗组、hnRNP B1单抗-DDP交联物组,分别加入DDP 3、5及7μg/mL,hnRNP B1单抗2.5、5及10μg/mL,交联物1.5、3及6μg/mL,培养2 h后,用培养基洗涤(仅对单抗组和交联物组进行洗涤),再分别作用12、24及48 h。以DDP组为阳性对照,同时设空白对照。每组设3个复孔。应用3H胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入法在液闪仪上测定每分钟细胞计数(CPM),了解不同干预以及不同剂量、作用时间交联物对细胞增殖的影响;采用TUNEL技术观察细胞凋亡情况;应用流式细胞计数测定交联物对细胞周期分布的影响。结果DDP(7μg/mL)、hnRNP B1单抗(5μg/mL)、交联物(3μg/mL)作用48 h对A549细胞均有生长抑制作用,生长抑制率分别为49.7%、53.3%、59.2%。3μg/mL交联物组(30.4%、46.2%及59.2%)和6μg/mL交联物组(41.3%、52.5%及66.8%)作用12、24及48 h后的生长抑制率均强于同时间点7μg/mL DDP组(25.0%、41.3%及49.7%)。DDP(7μg/mL)、hnRNP B1单抗(5μg/mL)、交联物(3μg/mL)作用48 h后均可诱导A549肺癌细胞凋亡。A549细胞经交联物作用后,G0/G1期细胞增多(占53.9%),S期细胞减少(占43.2%),与DDP组(46.8%和47.1%)和单抗组(46.4%和46.3%)比较均有显著差异(P均<0.01)。结论hnRNP B1单克隆抗体与DDP的交联物可与肺癌细胞发生特异性结合,具有靶向抗癌作用。

抗异质性胞核核糖核蛋白(hnRNP)抗体与自身免疫病的关系

抗异质性胞核核糖核蛋白（ｈｎＲＮＰ）抗体在自身免疫性疾病的研究中具有重要意义。类风湿性关节炎（ＲＡ）、系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）和混合型结缔组织病（ＭＣＴＤ）中的抗ｈｎＲＮＰ抗体主要是针对ｈｎＲＮＰＡ／Ｂ蛋白质，其中针对３ 种ｈｎＲＮＰ蛋白质Ａ２、Ｂ１、Ｂ２（ＲＡ３３ 复合物）的自身抗体又称抗ＲＡ３３ 抗体，检查抗ＲＡ３３ 抗体有助于ＲＡ的早期诊断。抗ｈｎＲＮＰ抗体不仅是有价值的诊断指标。

hnRNP A2/B1在胃癌中的表达及其临床意义

目的:在既往的胃癌蛋白质组研究中我们已发现hnRNP A2/B1具有较高表达,本试验进一步探讨hnRNPA2/B1在胃癌中的表达情况及其与胃癌临床病理特征的关系。方法:用免疫组织化学方法检测122例胃癌患者的胃癌组织及癌旁正常胃粘膜中hnRNP A2/B1蛋白的表达。结果:hnRNP A2/B1在胃癌组织中核表达的阳性率为92.6%(113/122),其中伴有胞浆表达的阳性率为7.3%(9/122)。在癌旁非瘤组织中核表达阳性率为87.7%(107/122),未见胞浆表达。hnRNP A2/B1的表达状态与胃癌临床病理特征无关联。结论:在胃癌及癌旁非瘤组织中均可发现hnRNP A2/B1核表达,hnRNP A2/B1不能作为肿瘤相关的分子标志物。

HSVⅠ感染L-02细胞对核不均一性核糖核蛋白H2(hnRNP H2)表达影响

单纯疱疹病毒(HSVⅠ)对宿主细胞转录及mRNA修饰翻译通路的调控是一个系统的、复杂的体系,探索其具体机制将有助于了解病毒复制过程及与宿主细胞之间的相互作用。基于2-DE分析,人正常肝细胞L-02细胞核不均一性核糖核蛋白H2(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2,hnRNP H2)在感染HSVⅠ前后存在表达差异,通过Western blot,Northern blot等技术方法验证其在病毒复制过程中不同时段对其表达影响。

hnRNP A1的功能研究进展

核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)是一类多功能RNA结合蛋白家族,能与RNA聚合酶Ⅱ合成的新生转录本结合,并以复合体形式参与转录本稳定与成熟调控过程.hnRNP A1是hnRNPs家族重要成员,不仅广泛参与癌症与神经系统疾病相关基因的可变剪接调控,还在病毒侵染、细胞衰老及应激恢复中发挥重要作用.此外,hnRNP A1作为典型的RNA结合蛋白,在转录与可变剪接调控过程中,可通过动态三维结构识别特定序列.本文总结了hnRNP A1的最新研究进展,以期为进一步探究hnRNP A1在疾病发生中的功能研究提供参考.

抗人hnRNP A1单克隆抗体的制备及在颅咽管瘤组织中的应用

目的制备核不均一核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1,hnRNP A1)的单克隆抗体,探讨hnRNP A1蛋白的生物学功能。方法利用重组hnRNP A1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行常规融合,通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得鼠抗hnRNPA1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western Blot和免疫组织化学实验等方法分别对其效价和特异性进行鉴定。结果成功地建立了3株稳定分泌抗hnRNPA1的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为E006、E009和E012。3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。3株单克隆抗体通过组织化学实验和Western Blot实验都能特异性地结合真核细胞内源性的hnRNPA1蛋白。结论获得了效价高、特异性好的抗hnRNP A1蛋白的单克隆抗体,这为进一步研究hnRNP A1的生物学功能及它在癌发生事件中的作用奠定了基础。

HnRNP A_2/B_1和P_(53)蛋白对肺癌诊断价值的探讨

目的：采用流式细胞术检测肺癌患者支气管肺泡灌洗液（BALF）脱落细胞中HnRNP A2/B1和外周血单个核细胞中P53蛋白水平,探讨联检HnRNP A2/B1和P53蛋白在肺癌诊断中应用价值。方法：收集30例肺癌患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）的脱落细胞和其外周血,用流式细胞术检测脱落细胞表达HnRNP A2/B1和外周血中的P53蛋白水平;同时检测30例肺部良性疾病患者为对照组。结果：肺癌患者的BALF脱落细胞表达HnRNP A2/B1的含量明显高于对照组（P〈0.01）;非小细胞肺癌患者中HnRNP A2/B1明显高于小细胞肺癌（P〈0.05）。NSCK临床TNM分期Ⅰ-Ⅱ期的患者与Ⅲ-Ⅳ期相比,HnRNP A2/B1无显著性差异（P〉0.05）。肺癌患者外周血中P53蛋白明显异于对照组（P〈0.01）;小细胞肺癌患者的P53蛋白明显高于非小细胞肺癌（P〈0.01）。结论：FCM检测肺癌患者BALF脱落细胞中HnRNP A2/B1和外周血P53,有助于肺癌的早期诊断。

大鼠急性肺栓塞后hnRNP-E1的表达及胶原代谢的变化

目的研究大鼠急性肺栓塞模型肺组织中异源性核糖核蛋白E1(heterogeneous nuclear ribonucleoprote E1,hnRNP-E1)的表达变化及其对胶原代谢的影响。方法建立大鼠急性肺栓塞模型,分别在急性肺栓塞后1、2、7和21d开胸取出肺组织,然后提取肺组织的总RNA和总蛋白,以正常大鼠为对照组,采取半定量RT-PCR的方法研究hnRNP-E1在mRNA水平表达的变化;采用Western blot方法进一步验证hnRNP-E1在蛋白水平表达的变化。采用Northern blot法分析大鼠肺组织中Collagen α1(Ⅰ)(COL1A1)和Collagen α1(Ⅲ)(COL3A1)在肺栓塞后mRNA水平的表达变化;采用羟脯氨酸(HYP)和Masson染色观察急性肺栓塞3周后肺组织内的胶原沉积状况。结果在大鼠急性肺栓塞后的不同时间点,hnRNP-E1的mRNA水平和蛋白水平的表达均有显著升高。大鼠急性肺栓塞后肺组织中COL1A1的mRNA表达水平有明显升高,但是COL3A1的mRNA表达水平无显著变化。HYP分析和Masson染色均显示急性肺栓塞3周后肺组织内的胶原沉积明显增加。结论大鼠急性肺栓塞后肺组织内hnRNP-E1的表达升高,可能促进了COL1A1的蛋白表达和胶原在肺部的沉积。

hnRNP A2/B1基因克隆及在肺癌组织中表达的初步探讨

背景与目的目前肺癌治疗中存在无早期特异性诊断指标的难题。本研究旨在获得hnRNPA2/B1cDNA序列,研究其在肺癌组织中的表达情况,为肺癌早期诊断治疗提供实验依据。方法从培养的A549肺腺癌细胞中提取总RNA进行逆转录反应,经PCR扩增目的片段,将其克隆于PUCm-T质粒上,并经酶切电泳、DNA测序鉴定分析。采用原位杂交方法,利用特异的cDNA探针,检测41例肺癌、13例非肺癌组织中hnRNPA2/B1的表达情况。结果从培养的A549肺腺癌细胞提取的总RNA中扩增到目的片段,并经测序证实该片段为hnRNPA2/B1编码序列。原位杂交显示肺癌组hnRNPA2/B1阳性率为87.8%(36/41),显著高于非肺癌组23.1%(3/13)(P<0.01)。其在胞浆、胞核均有表达,主要在胞浆表达。四种类型肺癌组织均显示hnRNPA2/B1阳性染色,其中鳞癌细胞染色阳性率为91.3%(21/23),似高于腺癌细胞78.6%(11/14),但两组间无显著性差异(P>0.05)。结论hnRNPA2/B1可以被成功克隆。初步证实hnRNPA2/B1在肺癌组织中呈高表达,但与肺癌组织类型无明显关系。

HnRNP A2/B1短发夹环RNA重组体的构建与序列分析

目的:利用RNA干扰(RNAinterfering,RNAi)技术构建HnRNPA2/B1重组质粒,并行序列分析。方法:分别将21bP长短的HnRNPA2/B1靶序列,中间为7bP序列间隔的反向重复序列,置入PsiRNA-hH1neoG2质粒中,产生重组质粒PSiRNA-hH1neoG2HnRNPA2/B1。结果:将重组质粒作测序分析,经测序鉴定确定为所需序列。结论:特异性短发夹环RNA(ShRNA)真核表达载体PSiRNA-hH1neoG2HnRNPA2/B1的成功构建,为进一步研究其基因功能奠定基础。

hnRNPs的结构、功能及其相关疾病的研究进展

hnRNPs是一大类RNA结合蛋白(RBPs),参与核酸代谢各过程。hnRNPs具有功能多样性和复杂性,除了参与癌症的发生发展外,还与各种神经退行性疾病,自身免疫性疾病等密切相关。现对hnRNPs家族的结构,功能及其参与的相关疾病做一综述。