hok/sok-parDE增强鼠伤寒沙门菌菌毛编码质粒稳定性研究

将编码两个质粒稳定系统的融合基因克隆至表达鼠沙门菌Ⅰ型菌毛(fim)基因的质粒pAZ44中,获得pAZ44-h。将两质粒分别转化鼠伤寒沙门菌,连续培养144 h,每隔12 h转接1代,并取样,用抗性平板计数细菌,通过抗性检测质粒存在状况。结果发现,质粒pAZ44在细菌培养12 h^24 h后开始丢失,而含稳定系统的质粒pAZ44-h在连续培养10代或120 h都未发生丢失。表明aphA-hok-parDE序列显著增强了质粒的稳定性,为进一步研究鼠沙门菌Ⅰ型菌毛的功能奠定了基础。

重组质粒pACYC184-hok/sok的构建及稳定性研究

以低拷贝质粒pACYC184为载体,将hok/sok基因插入到载体BamHⅠ位点,构建重组质粒pACYC184-hok/sok稳定系统,同时构建hok/sok基因缺失突变重组质粒pACYC184-hok/sok(M)。通过对构建的重组菌进行连续传代和对不同代次的重组质粒进行SphⅠ酶切,分析hok/sok基因的引入对宿主细胞生长的影响。结果表明,重组质粒pACYC184-hok/sok在无抗生素筛选压力下连续传代,传至第135代时质粒稳定率仍是100%,且传代前后的质粒SphⅠ酶切图谱没有发生变化,DNA序列测定表明,插入的hok/sok基因没有发生任何突变。突变重组质粒pACYC184-hok/sok(M)传代前后的质粒SphⅠ酶切结果虽没有发生变化,但其相应的重组菌传至第15代,质粒几乎完全丢失。生长曲线的测定结果表明,与含pACYC184重组菌生长曲线相似,pACYC184-hok/sok重组菌生长较快,而pACYC184-hok/sok(M)重组菌生长缓慢。以上结果表明,含hok/sok稳定系统,其稳定性明显高于无hok/sok稳定系统的质粒pACYC184以及突变质粒pACYC184-hok/sok(M)。重组质粒pACYC184-hok/sok具有良好的结构稳定性和分离稳定性。